【摘要】：豬腺病毒3型(Porcine adenovirus type 3,PAd V-3)是豬腺病毒的優(yōu)勢血清型,幾乎沒有致病性,廣泛分布于世界各地的豬群中。雖然該腺病毒僅感染豬,不感染人類和其他動物,但是該病毒可以轉(zhuǎn)導(dǎo)多種人和動物的細胞。以該病毒為基礎(chǔ)的載體增殖滴度高,可以穩(wěn)定地攜帶外源基因并實現(xiàn)外源基因在轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中高效表達。此外,該病毒與人腺病毒之間沒有交叉免疫反應(yīng),因此,豬腺病毒3型載體既可以作為豬用疫苗的投遞系統(tǒng),又具有作為人用基因治療和疫苗投遞系統(tǒng)的潛力。盡管PAd V-3具有很多優(yōu)點,但是在其應(yīng)用之前,特別是在人類臨床應(yīng)用方面,仍需進行大量的評估。然而,豬腺病毒載體的研究遠落后于人腺病毒載體。一方面,雖然目前已經(jīng)成功構(gòu)建了豬腺病毒載體系統(tǒng),但是利用該系統(tǒng)構(gòu)建豬腺病毒載體是一個復(fù)雜,耗時的過程,限制了豬腺病毒載體的研究與應(yīng)用;另一方面,為什么研究衣殼?豬腺病毒載體衣殼表面展示的研究一直處于空白。為了突破這些瓶頸,本研究首先構(gòu)建了簡便、高效、廉價的豬腺病毒表達平臺,并在研究豬腺病毒3型次要結(jié)構(gòu)蛋白IX功能的基礎(chǔ)之上,構(gòu)建了豬腺病毒表面展示平臺,這些研究結(jié)果為后續(xù)豬腺病毒載體的改造和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。1.一種高效的PAd V-3表達系統(tǒng)的構(gòu)建作為一種人腺病毒的候選替代載體,豬腺病毒載體已經(jīng)被應(yīng)用于人和動物的疫苗研究。然而,依賴重組酶A(Rec A)的重組技術(shù)的豬腺病毒載體的構(gòu)建過程復(fù)雜,耗時費力。為了克服這一缺點,本研究構(gòu)建了一個基于SLi CE克隆技術(shù)和致死基因Ccd B篩選技術(shù)的PAd V-3表達系統(tǒng)。研究表明,利用該系統(tǒng)可以在3 days內(nèi)通過單次PCR、單次SLi CE反應(yīng)、單次常規(guī)轉(zhuǎn)化構(gòu)建豬腺病毒載體質(zhì)粒,其克隆效率高達620±49.56 CFU/ng,克隆精確度為大于99%,隨機挑選的陽性克隆可以成功進行病毒拯救,并且重組病毒能有效的在宿主細胞中表達外源基因。這些結(jié)果表明,我們構(gòu)建了一個簡便、高效、廉價的豬腺病毒表達系統(tǒng)。2.p IX的C端融合紅色熒光蛋白mcherry影響PAd V-3的復(fù)制p IX是腺病毒載體理想的表面展示平臺。為了評估p IX作為PAd V-3表面展示平臺的可能性,本研究將熒光蛋白mcherry融合到PAd V-3的p IX的C末端,構(gòu)建了重組豬腺病毒載體,并對載體特性進行了評估。結(jié)果表明,p IX的C端融合mcherry的r PAd V-3雖然可以被拯救,但是其在宿主細胞中的復(fù)制能力嚴(yán)重下降。研究還發(fā)現(xiàn),p IX的C端融合mcherry以后,該融合蛋白不能有效定位于細胞核中,這也許是該重組病毒復(fù)制能力下降的原因。這些結(jié)果表明,通過在PAd V-3 p IX C末端融合進行表面展示外源多肽會影響病毒的復(fù)制。這也提示,p IX在PAd V-3的復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。3.p IX是PAd V-3的復(fù)制非必需基因p IX是一個多功能蛋白,在病毒生活史的多個環(huán)節(jié)中均發(fā)揮重要作用。本研究通過對PAd V-3的p IX進行缺失突變,構(gòu)建重組病毒,進行病毒拯救試驗,并對拯救獲得的重組病毒的生物學(xué)特性進行詳細研究。研究結(jié)果表明,p IX缺失的重組PAd V-3可以成功的被拯救,但是p IX缺失后,該病毒的熱穩(wěn)定性、復(fù)制能力以及其形成噬斑能力均顯著下降。這些結(jié)果提示:p IX是PAd V-3衣殼蛋白的成分,該蛋白對病毒的包裝和衣殼的形成是非必需的,但是其在病毒衣殼穩(wěn)定的維持、病毒復(fù)制以及病毒致細胞病變中均發(fā)揮重要作用。4.PAd V-3的p IX C端結(jié)構(gòu)域的缺失影響病毒的復(fù)制為了進一步解析PAd V-3的p IX的功能,本研究通過氨基酸序列比對和結(jié)構(gòu)分析,將PAd V-3的p IX蛋白分為N端保守區(qū),Coiled-Coil結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域,其中其C端結(jié)構(gòu)域是PAd V-3的特有的。通過對PAd V-3 C端結(jié)構(gòu)域進行缺失突變,構(gòu)建重組病毒,進行病毒拯救試驗,并對拯救獲得的病毒的生物學(xué)特性進行測定。研究結(jié)果表明,雖然缺失C端結(jié)構(gòu)域不影響該病毒的熱穩(wěn)定性,但是該病毒的復(fù)制能力和致細胞病變能力均遠低于野生型PAd V-3,而與完全缺失p IX的病毒相似。這些研究結(jié)果表明,雖然PAd V-3的p IX C端結(jié)構(gòu)域與病毒衣殼的穩(wěn)定性無關(guān),但是該區(qū)域是p IX影響PAd V-3高效復(fù)制的關(guān)鍵功能域。5.p IX嵌合法實現(xiàn)PAd V-3表面展示的研究p IX在腺病毒衣殼中有240拷貝,通過其C末端融合,可以將多種不同配體同時展示在病毒衣殼表面上�？紤]到p IX對PAd V-3復(fù)制的重要性,本研究采用野生型p IX和融合p IX嵌合的策略,以期實現(xiàn)PAd V-3的衣殼表面展示。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),嵌合病毒具有和野生型病毒相似的復(fù)制能力和熱穩(wěn)定性,而且p IX-mcherry融合蛋白可以展示到病毒表面上。這一結(jié)果表明,采用p IX嵌合法可以成功實現(xiàn)PAd V-3的衣殼表面展示。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【圖文】：

圖 1-1、 腺病毒粒子的組成與結(jié)構(gòu)Fig 1-1. Overall AdV structure and components.(a) 正二十面體衣殼結(jié)構(gòu)及組成。左邊為一個低分辨率的冷凍電鏡建模圖。右面為正二十面體一個三角形面的模式圖。(b) 非衣殼蛋白組成。(a) Icosahedral shell organization according to current structural knowledge. (b) Non-icosahedralcomponents.1.2 腺病毒載體病毒載體是最理想基因投遞系統(tǒng)。據(jù)統(tǒng)計，以腺病毒載體為投遞系統(tǒng)的臨床試驗占所有的基因治療的臨床試驗的 23.5%。與其他基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)相比，腺病毒載體具有以下優(yōu)勢：（1）腺病毒載體既能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細胞，又能轉(zhuǎn)導(dǎo)靜息細胞。（2）腺病毒不整合到宿主細胞基因組，插入變異風(fēng)險低（Stephen et al. 2010）。（3）腺病毒載體的插入容量大，第三代腺病毒載體的插入容量可以達到 36kb。（4）腺病毒載體的滴度高，易于大量制備目前，符合 GMP 的腺病毒載體的培養(yǎng)和純化工藝已經(jīng)被開發(fā)出來。在人類的 57 個血清型中，以 C 群的人腺病毒 5 型（HAdV-5）的研究最為清楚，以

第一章 動物腺病毒載體研究進展 Emini.2004）。然而，研究表明,80%的成年人群自然感染過腺病毒，機體存在針對腺病毒的體液免疫和細胞免疫（Garnett et al.2002）。先前存在的免疫反應(yīng)不但影響基因投遞的效果（Kuriyama et al. 1998），而且針對病毒載體和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的免疫反應(yīng)會導(dǎo)致多種副作用。2003 年，在應(yīng)用腺病毒載體進行基因治療時，高滴度腺病毒載體引起了全身炎癥反應(yīng)綜合征，造成了病人死亡，這一事件給腺病毒載體的應(yīng)用敲響了警鐘（Raper et al2003）。此外，病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟和脾臟的免疫細胞導(dǎo)致的免疫反應(yīng)也嚴(yán)重影響腺病毒載體的治療效果。改變的腺病毒的肝臟嗜性和腺病毒的中和表位是降低腺病毒載體的免疫反應(yīng)的有效途徑。腺病毒衣殼蛋白結(jié)構(gòu)及其與受體的相互作用的多樣性使得解決先前存在的腺病毒的免疫反應(yīng)成為可能。目前，已經(jīng)多種稀有血清型的人類腺病毒和動物腺病毒載體被開發(fā)出來，并逐步應(yīng)用于疫苗開發(fā)和基因治療的研究。1.3 腺病毒免疫研究進展1.3.1 腺病毒介導(dǎo)的免疫反應(yīng)

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 張鵬;新型豬3型腺病毒（PAdV-3）表達系統(tǒng)及衣殼表面展示系統(tǒng)的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

本文編號：2729885