本文關(guān)鍵詞：硫礦硫化葉菌Hsp14.1和Hsp20.1的結(jié)構(gòu)和分子伴侶活性調(diào)控機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：小熱激蛋白是分子伴侶中的超級家族,幾乎存在于所有生物體和多個細胞組織中。在壓力條件下,小熱激蛋白能夠結(jié)合并抑制變性客戶蛋白的聚集和沉淀而發(fā)揮重要的作用。生物體在缺失小熱激蛋白的分子伴侶功能后會對環(huán)境壓力如熱,低氧,酸或堿等變得敏感。人源中的小熱激蛋白的功能缺失會導(dǎo)致自身免疫性疾病,神經(jīng)變性紊亂,白內(nèi)障等多重疾病的發(fā)生。但是關(guān)于小熱激蛋白在壓力條件下與客戶蛋白的相互作用機制以及使細胞耐受壓力的機制,我們知之甚少。越來越多的研究表明大約由25個氨基酸組成的N末端對小熱激蛋白與底物的結(jié)合非常關(guān)鍵,但是具體的底物的結(jié)合機制以及相關(guān)的分子伴侶活性調(diào)節(jié)機制仍然沒有研究透徹。關(guān)于N末端怎么能夠適應(yīng)大小,形狀,表面疏水和帶電性等各異的不同種類的變性客戶蛋白一直難以解釋清楚。由于變性的客戶蛋白是多相的且沒有確定的三維結(jié)構(gòu),很難直接研究小熱激蛋白與客戶蛋白的復(fù)合物結(jié)構(gòu),因此,到目前為止,也還沒有獲得過N末端清晰可見且處于活性狀態(tài)的小熱激蛋白的三維結(jié)構(gòu)。本論文以硫礦硫化葉菌(Sulfolobus solfatataricus P2)來源的小熱激蛋白HSP14.1為研究對象,以結(jié)構(gòu)研究為基礎(chǔ),并結(jié)合體內(nèi)體外功能實驗,驗證分析N末端的構(gòu)象變化以適配非活性客戶蛋白的分子機制。我們解析了Hsp14.1的野生型以及突變體A102D和Del-C4的三維結(jié)構(gòu),三個結(jié)構(gòu)都有完整而清晰的N末端,但是N末端的構(gòu)象卻有很大的差異。野生型的N末端呈現(xiàn)為直的螺旋,但是突變體的N末端螺旋卻發(fā)生了嚴重的扭結(jié)與破壞。扭結(jié)與破壞的螺旋形成了一個疏水口袋似乎能夠識別未折疊的客戶蛋白。隨后,功能上的突變研究表明對這個疏水口袋的關(guān)鍵氨基酸突變會影響宿主菌在熱壓力下的存活率。通過結(jié)構(gòu)對比分析,發(fā)現(xiàn)直的N末端螺旋不能形成疏水口袋。野生型和突變體的N末端的結(jié)構(gòu)差異表明N末端存在一個分子開關(guān)能夠使Hsp14.1從靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變到活性狀態(tài)。同樣的機制可能應(yīng)用到同家族的其它小熱激蛋白中。基于結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),普遍認為依靠β6鏈存在與否的二聚化模式可以區(qū)分后生動物和非后生動物的小熱激蛋白。本研究中解析的硫礦硫化葉菌Hsp20.1 ACD二聚體結(jié)構(gòu)卻展示了一個完全不同的二聚體界面。我們發(fā)現(xiàn),雖然沒有β6鏈,Hsp20.1 ACD二聚體既沒有像后生動物的小熱激蛋白那樣依靠β7鏈形成二聚體界面,也沒有解聚成單體。這與所有已報道的小熱激蛋白的結(jié)構(gòu)不同。Hsp20.1 ACD二聚體結(jié)構(gòu)揭示了一個可變的,高度極性的二聚體界面,有利于快速地進行亞基交換和底物識別。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)Hsp20.1的C末端突變體盡管不能形成多聚體結(jié)構(gòu),但仍然具有分子伴侶活性。進一步的突變研究表明N末端對Hsp20.1多聚體和二聚體的底物結(jié)合很關(guān)鍵。另外,有大量研究表明小熱激蛋白在熱壓力下能夠通過抑制聚集來保護細胞,但是關(guān)于酸壓力下小熱激蛋白對細胞的保護功能卻不見報道。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)Hsp20.1和Hsp14.1多聚體在低p H條件下能夠發(fā)生解離,甚至呈現(xiàn)二聚體和單體,仍然有分子伴侶活性。而它們在50°C條件下卻沒有顯著的四級結(jié)構(gòu)改變,但也有抑制底物聚集的能力。這些結(jié)果表明小熱激蛋白在不同的壓力條件下可能有不同的發(fā)揮功能的模式。
【關(guān)鍵詞】：小熱激蛋白 分子開關(guān) 二聚體界面 酸壓力 溫度壓力
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q936
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 縮略符號13-14
• 第一章 緒論14-44
• 1.1 小熱激蛋白維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要性及與疾病的關(guān)聯(lián)14-21
• 1.1.1 小熱激蛋白與細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)14-17
• 1.1.2 小熱激蛋白與疾病的關(guān)聯(lián)17-21
• 1.2 小熱激蛋白的結(jié)構(gòu)特征21-27
• 1.2.1 小熱激蛋白的結(jié)構(gòu)組成21-22
• 1.2.2 小熱激蛋白的單體和二聚體結(jié)構(gòu)22-23
• 1.2.3 小熱激蛋白的多聚體結(jié)構(gòu)23-25
• 1.2.4 小熱激蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性25
• 1.2.5 小熱激蛋白結(jié)構(gòu)的動態(tài)平衡25-27
• 1.3 小熱激蛋白的分子伴侶功能27-35
• 1.3.1 熱激活效應(yīng)28-29
• 1.3.2 酸激活效應(yīng)29-30
• 1.3.3 氧化激活效應(yīng)30-32
• 1.3.4 結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系32
• 1.3.5 底物保護機制32-35
• 1.4 小熱激蛋白與底物復(fù)合物的研究進展35-38
• 1.4.1 底物結(jié)合區(qū)域35-36
• 1.4.2 復(fù)合物結(jié)構(gòu)36
• 1.4.3 小熱激蛋白與底物結(jié)合的動態(tài)平衡36-38
• 1.5 古菌中的小熱激蛋白38-43
• 1.5.1 古菌中小熱激蛋白的結(jié)構(gòu)特點38-42
• 1.5.2 古菌中小熱激蛋白的功能特點42-43
• 1.5.3 小熱激蛋白SsHsp14.1 和SsHsp20.1 簡介43
• 1.6 本論文研究的目的和意義43-44
• 第二章 材料和方法44-69
• 2.1 實驗材料44-52
• 2.1.1 基因44
• 2.1.2 大腸桿菌菌株44-45
• 2.1.3 質(zhì)粒45
• 2.1.4 常用試劑和耗材45-47
• 2.1.5 結(jié)晶篩選與優(yōu)化試劑盒47
• 2.1.6 實驗儀器47-49
• 2.1.7 溶液配制49-52
• 2.2 實驗方法52-69
• 2.2.1 基因克隆52-56
• 2.2.2 蛋白表達與純化56-61
• 2.2.3 蛋白質(zhì)晶體生長與優(yōu)化61-63
• 2.2.4 X射線晶體結(jié)構(gòu)測定63-65
• 2.2.5 序列比對65
• 2.2.6 分子篩（SEC）分析sHsps的寡聚體狀態(tài)65-66
• 2.2.7 圓二色譜（CD）實驗66-67
• 2.2.8 sHsps的體外分子伴侶活性實驗67
• 2.2.9 sHsps抑制底物沉淀的SDS-PAGE實驗67-68
• 2.2.10 菌落形成實驗68-69
• 第三章 SsHsp14.1 的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究69-96
• 3.1 SsHsp14.1 的生物信息學(xué)分析69-70
• 3.2 SsHsp14.1 的表達純化70-79
• 3.2.1 HISGST-SsHsp14.1 的表達與純化71-73
• 3.2.2 HISGST-SsHsp14.1 的結(jié)晶條件篩選及優(yōu)化73-74
• 3.2.3 HIS-SsHsp14.1 的表達純化與結(jié)晶74
• 3.2.4 CBD-SsHsp14.1 的表達純化74-75
• 3.2.5 SsHsp14.1-C-HIS的表達純化75-76
• 3.2.6 無親和標簽的SsHsp14.1 的表達純化76-79
• 3.3 SsHsp14.1 的結(jié)晶與優(yōu)化79-86
• 3.3.1 SsHsp14.1 的結(jié)晶條件初篩79-80
• 3.3.2 SsHsp14.1 的結(jié)晶條件優(yōu)化80-84
• 3.3.3 SsHsp14.1 的結(jié)晶條件復(fù)篩與優(yōu)化84-86
• 3.4 SsHsp14.1 的結(jié)構(gòu)分析86-94
• 3.4.1 SsHsp14.1 的結(jié)構(gòu)解析86-88
• 3.4.2 N端可見的SsHsp14.1 的三維結(jié)構(gòu)88-92
• 3.4.3 缺失突變驗證N端對結(jié)合底物的重要性92-94
• 3.5 本章小結(jié)94-96
• 第四章 SsHsp14.1 的自組裝復(fù)合物結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究96-116
• 4.1 復(fù)合物的研究方法分析96
• 4.2 突變體設(shè)計及表達純化96-100
• 4.2.1 IXI基序缺失突變體的表達純化96-98
• 4.2.2 β4-β8 疏水溝區(qū)域的突變體的表達純化98-100
• 4.3 突變體的結(jié)晶及優(yōu)化100-104
• 4.3.1 IXI基序缺失突變體的結(jié)晶100-101
• 4.3.2 β4-β8 疏水溝區(qū)域的突變體的結(jié)晶101-104
• 4.4 突變體的結(jié)構(gòu)分析104-114
• 4.4.1 Del-C4 的三維結(jié)構(gòu)104-106
• 4.4.2 A102D的三維結(jié)構(gòu)106-108
• 4.4.3 Del-C4 和A102D自組裝復(fù)合物的形成的作用方式分析108-112
• 4.4.4 Del-C4 和A102D及WT的結(jié)構(gòu)對比分析112-113
• 4.4.5 關(guān)鍵氨基酸介導(dǎo)的N末端的構(gòu)象轉(zhuǎn)換113-114
• 4.5 本章小結(jié)114-116
• 第五章 SsHsp14.1 結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的體外的底物保護機制研究116-123
• 5.1 突變體設(shè)計116
• 5.2 熱變性條件下的分子伴侶活性116-118
• 5.3 化學(xué)變性條件下的分子伴侶活性118-122
• 5.4 本章小結(jié)122-123
• 第六章 SsHsp14.1 結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的體內(nèi)的底物保護機制研究123-139
• 6.1 N末端的疏水氨基酸基序123
• 6.2 N末端的氨基酸突變策略123-124
• 6.3 體內(nèi)實驗驗證參與分子伴侶活性的N末端的關(guān)鍵氨基酸124-130
• 6.3.1 負突變驗證124-127
• 6.3.2 正突變驗證127-128
• 6.3.3 正負突變的菌體存活率分析128-130
• 6.4 基于結(jié)構(gòu)和功能分析N末端調(diào)節(jié)的底物保護機制130-137
• 6.4.1 N末端調(diào)控多聚體結(jié)構(gòu)的組裝130-131
• 6.4.2 N末端調(diào)節(jié)分子伴侶活性131-135
• 6.4.3 底物保護機制分析135-137
• 6.5 本章小結(jié)137-139
• 第七章 SsHsp20.1 的結(jié)構(gòu)和功能特性研究139-163
• 7.1 SsHsp20.1 的生物信息學(xué)分析139-141
• 7.2 SsHsp20.1 的表達純化141-147
• 7.2.1 SsHsp20.1 WT的表達純化141-144
• 7.2.2 SsHsp20.1 截斷體的表達純化144-147
• 7.3 SsHsp20.1 的結(jié)晶147-149
• 7.3.1 SsHsp20.1 WT的結(jié)晶147-148
• 7.3.2 SsHsp20.1 截斷體的結(jié)晶148-149
• 7.4 SsHsp20.1 的ACD結(jié)構(gòu)解析149-155
• 7.4.1 SsHsp20.1 ACD的三維結(jié)構(gòu)149-151
• 7.4.2 SsHsp20.1 和SsHsp14.1 的三維結(jié)構(gòu)比對分析151-152
• 7.4.3 β6 缺失的多極性的SsHsp20.1 的二聚體形成界面152-155
• 7.5 SsHsp20.1 的C末端參與多聚體結(jié)構(gòu)的組裝155-159
• 7.6 SsHsp20.1 的N末端對底物的結(jié)合至關(guān)重要159-160
• 7.7 本章小結(jié)160-163
• 第八章 SsHsp20.1 和SsHsp14.1 在不同壓力條件下的結(jié)構(gòu)和功能差異研究163-185
• 8.1 酸誘導(dǎo)的四級結(jié)構(gòu)變化164-167
• 8.1.1 SsHsp20.1 在不同pH條件下的四級結(jié)構(gòu)164-166
• 8.1.2 SsHsp14.1 在不同pH條件下的四級結(jié)構(gòu)166-167
• 8.2 酸誘導(dǎo)的二級結(jié)構(gòu)變化167-170
• 8.2.1 SsHsp20.1 在不同pH條件下的二級結(jié)構(gòu)167-169
• 8.2.2 SsHsp14.1 在不同pH條件下的二級結(jié)構(gòu)169-170
• 8.3 酸壓力條件下的分子伴侶活性研究170-177
• 8.3.1 SsHsp20.1 在pH 4.0 條件下的分子伴侶活性170-172
• 8.3.2 SsHsp14.1 在pH 4.0 條件下的分子伴侶活性172-174
• 8.3.3 SsHsp20.1 和SsHsp14.1 從pH 2.0 回復(fù)到pH 7.0 條件下的分子伴侶活性174-177
• 8.4 溫度壓力條件下的結(jié)構(gòu)變化177-180
• 8.4.1 溫度誘導(dǎo)的SsHsp20.1 和SsHsp14.1 四級結(jié)構(gòu)變化177-179
• 8.4.2 溫度誘導(dǎo)的SsHsp20.1 和SsHsp14.1 二級結(jié)構(gòu)變化179-180
• 8.5 SsHsp20.1 和SsHsp14.1 在 50 °C下的分子伴侶活性180-181
• 8.6 酸和溫度壓力條件下的結(jié)構(gòu)和分子伴侶活性的差異性分析181-183
• 8.6.1 不同的壓力感應(yīng)強度和方式181-182
• 8.6.2 不同的底物結(jié)合模式182-183
• 8.7 本章小結(jié)183-185
• 結(jié)論185-188
• 參考文獻188-201
• 攻讀博士/碩士學(xué)位期間取得的研究成果201-202
• 致謝202-204
• 附件204

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