本文關(guān)鍵詞：mTOR信號(hào)途徑調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)控能力的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是存在于骨髓和其他多種組織中的成體干細(xì)胞。MSCs具有廣泛的免疫調(diào)控作用,目前已在臨床上應(yīng)用于移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)和自身免疫性疾病等的治療。慢性GVHD (chronic GVHD, cGVHD)是影響異基因造血干細(xì)胞移植(]hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)效果的主要并發(fā)癥,其臨床表現(xiàn)與多種自身免疫性疾病類(lèi)似。有研究報(bào)道MSCs在部分自身免疫性疾病中存在衰老、凋亡和增殖能力減弱等現(xiàn)象,可能參與了疾病的發(fā)病過(guò)程。cGVHD患者M(jìn)SCs是否也有類(lèi)似現(xiàn)象,能否用自體MSCs進(jìn)行細(xì)胞治療尚不明確。 MSCs發(fā)揮免疫調(diào)控作用需要炎性微環(huán)境的激活。然而,在炎性細(xì)胞因子作用下,MSCs出現(xiàn)損傷并增加免疫原性,限制了其在GVHD等多種疾病中的治療作用。mTOR信號(hào)途徑參與調(diào)控多種免疫反應(yīng),對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞激活和分化等具有重要的調(diào)控作用。另外,mTOR信號(hào)途徑還參與調(diào)控B16黑色素瘤細(xì)胞等表面MHC分子的表達(dá)。然而,在MSCs中mTOR信號(hào)途徑是否能調(diào)節(jié)免疫抑制能力和免疫原性尚不清楚。 本研究旨在闡明MSCs在cGVHD發(fā)生發(fā)展中的作用,并探討自體MSCs治療cGV HD的可行性；探討mTOR信號(hào)途徑對(duì)MSCs免疫抑制能力和免疫原性的調(diào)節(jié)作用及具體機(jī)制,為改善MSCs治療GVHD等疾病奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第一章慢性移植物抗宿主病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性研究 目的：比較分析HSCT后cGVHD患者和無(wú)cGVHD患者骨髓MSCs的表型和功能,闡明MSCs在cGVHD發(fā)生發(fā)展中的作用；進(jìn)一步與正常供者骨髓MSCs比較,探討cGVHD患者M(jìn)SCs用于自體移植的可行性。 方法：分離培養(yǎng)25例異基因HSCT后cGVHD患者,16例無(wú)cGVHD患者和19例正常供者的骨髓MSCs,取第3-5代細(xì)胞進(jìn)行比較分析。短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)-PCR檢測(cè)HSCT后骨髓MSCs來(lái)源；成纖維細(xì)胞集落形成單位(CFU-F)培養(yǎng)法檢測(cè)MSCs在骨髓中的數(shù)量；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記、凋亡和免疫抑制能力；茜素紅染色和油紅O染色分別檢測(cè)MSCs成骨和成脂分化能力；衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色檢測(cè)細(xì)胞衰老；ELISA檢測(cè)MSCs正常培養(yǎng)和與外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)共培養(yǎng)后免疫抑制因子分泌水平；熒光定量PCR檢測(cè)多能性相關(guān)基因、衰老相關(guān)基因和分化相關(guān)基因表達(dá)水平；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MSCs遷移能力。 結(jié)果：HSCT后cGVHD患者和無(wú)cGVHD患者骨髓MSCs都來(lái)自患者自身。MSCs表面都強(qiáng)表達(dá)CD73、 CD90、 CD105,中等表達(dá)HLA-ABC,不表達(dá)CD34、 CD45、 CD11b、 CD19和HLA-DR。兩組MSCs在骨髓中的數(shù)量相當(dāng),具有相似的細(xì)胞形態(tài)、增殖和自我更新能力、分化潛能和遷移能力。MSCs的細(xì)胞衰老和凋亡百分比也無(wú)明顯差異。兩組MSCs的免疫抑制能力無(wú)明顯區(qū)別,都能顯著抑制植物凝集素(PHA)活化的PBMCs增殖；與CD4+T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)相比,MSCs與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后,能明顯增加CD4+CD25hiCD127-Tregs的比例；MSCs正常培養(yǎng)或與PBMCs共培養(yǎng)后免疫抑制因子TGF-p1、 IL-10、 HGF、 PGE2的分泌水平也類(lèi)似。另外,與正常供者骨髓MSCs相比,盡管cGVHD組MSCs在骨髓中的數(shù)量減少,而在表型和其他功能方面均無(wú)顯著差別。 結(jié)論：MSCs不參與cGVI ID的發(fā)生發(fā)展,cGVHD患者M(jìn)SCs具有正常的表型和功能,可能適用于自體細(xì)胞治療。 第二章nTOR信號(hào)途徑調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制能力的作用及機(jī)制 目的：闡明mTOR信號(hào)途徑對(duì)骨髓MSCs免疫抑制能力的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。 方法：MSCs預(yù)處理不同濃度雷帕霉素后與活化的PBMCs、小鼠脾細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)5天,流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)PBMCs、小鼠脾細(xì)胞增殖率和CD4+CD25hiCD127-細(xì)胞比例。熒光定量PCR檢測(cè)IFN-γ、 TNF-a受體和免疫抑制因子mRNA表達(dá)水平；Western blotting檢測(cè)COX-2、 mPGES-1等蛋白表達(dá)水平；慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾驗(yàn)證COX-2在MSCs免疫抑制中的作用；ELISA檢測(cè)雷帕霉素預(yù)處理后MSCs培養(yǎng)上清PGE2的分泌水平。 結(jié)果：雷帕霉素預(yù)處理抑制mTOR信號(hào)途徑后顯著增強(qiáng)MSCs對(duì)PBMCs增殖的抑制作用,對(duì)誘導(dǎo)Tregs作用沒(méi)有明顯影響。雷帕霉素預(yù)處理后,MSCs也能明顯抑制抗CD3/CD28抗體活化的小鼠脾細(xì)胞增殖。抑制mTOR信號(hào)途徑不影響炎性細(xì)胞因子IFN-γ、 TNF-a受體的表達(dá),但能顯著提高COX-2的mRNA和蛋白水平以及PGE2分泌水平。IFN-γ、 TNF-a也增強(qiáng)COX-2和PGE2的表達(dá),雷帕霉素預(yù)處理后能在炎性細(xì)胞因子作用基礎(chǔ)上進(jìn)一步上調(diào)。加入COX-2特異性抑制劑NS-398或shRNA干擾后能減弱雷帕霉素對(duì)MSCs免疫抑制的促進(jìn)作用。雷帕霉素引起MSCs中NF-κB入核,加入NF-κB抑制劑PDTC后雷帕霉素對(duì)COX-2蛋白表達(dá)的上調(diào)作用減弱。 結(jié)論：雷帕霉素預(yù)處理抑制mTOR信號(hào)途徑后通過(guò)上調(diào)MSCs的COX-2和PGE2表達(dá)增強(qiáng)免疫抑制作用。 第三章mTOR信號(hào)途徑調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性的作用 目的：闡明mTOR信號(hào)途徑對(duì)骨髓MSCs表面HLA-ABC和HLA-DR表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 方法：雷帕霉素預(yù)處理MSCs,正常培養(yǎng)或IFN--γ作用不同時(shí)間后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面HLA-ABC+、HLA-D R+細(xì)胞比例和平均熒光強(qiáng)度；熒光定量PCR檢測(cè)IRF1、CIITA以及蛋白酶體亞單位和MHC-I類(lèi)分子組裝相關(guān)分子伴侶的nRNA表達(dá)水平；Western blotting檢測(cè)Statl蛋白磷酸化水平。 結(jié)果：雷帕霉素處理對(duì)MSCs表面的HLA-ABC表達(dá)沒(méi)有影響。IFN-γ處理3天后明顯增強(qiáng)HLA-ABC平均熒光強(qiáng)度,并上調(diào)蛋白酶體亞單位LMP2、LMP7、LMP10以及分子伴侶Tapasin等的mRNA表達(dá)水平。雷帕霉素對(duì)IFN-γ作用下的HLA-ABC表達(dá)也沒(méi)有影響,但能提高Tapasin、 LMP7和LMP10的表達(dá)水平。MSCs正常條件下不表達(dá)HLA-DR,但在IFN-γ作用下表達(dá)明顯上升。IFN-γ作用后Statl蛋白的磷酸化水平和IRF1、CIITA的mRNA表達(dá)水平也明顯上升。雷帕霉素對(duì)Statl磷酸化水平和IRF1、CIITA的表達(dá)水平?jīng)]有影響,然而高濃度雷帕霉素預(yù)處理能顯著減弱IFN-7處理后的HLA-DR+細(xì)胞比例以及平均熒光強(qiáng)度。結(jié)論：雷帕霉素抑制mTOR信號(hào)途徑不影啊HLA-ABC表達(dá),但能減弱IFN-γ作用后的HLA-DR表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細(xì)胞 慢性移植物抗宿主病 雷帕霉素 免疫抑制 mTOR信號(hào)途徑 免疫原性
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 致謝5-6
• 前言6-9
• 中文摘要9-13
• 英文摘要13-18
• 縮略詞18-23
• 1 第一章：慢性移植物抗宿主病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性研究23-49
• 1.1 引言23-24
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料24-28
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法28-37
• 1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-46
• 1.5 討論46-49
• 2 第二章: mTOR信號(hào)途徑調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制能力的作用及機(jī)制49-75
• 2.1 引言49-50
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料50-53
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法53-58
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-71
• 2.5 討論71-75
• 3 第三章：mTOR信號(hào)途徑調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性的作用75-85
• 3.1 引言75-76
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料76
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法76-77
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果77-81
• 3.5 討論81-85
• 4 總結(jié)85-87
• 參考文獻(xiàn)87-97
• 綜述97-110
• 參考文獻(xiàn)104-110
• 作者簡(jiǎn)歷及在讀期間所取得的科研成果110-

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本文編號(hào)：271317