本文關鍵詞：提高體外成熟卵母細胞質(zhì)量研究：抑制GVBD的后作用及體外成熟系統(tǒng)優(yōu)化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：PARTI:通過抑制卵母細胞GVBD,增加胞質(zhì)成熟時間來提高體外成熟卵母細胞質(zhì)量的方法很少有成功的,主要由于缺乏對GVBD抑制期間發(fā)生分子事件了解。這方面的報道對研究卵母細胞GV期間基因表達調(diào)控也有重要借鑒意義。我們研究了不同物種間GVBD抑制對減數(shù)分裂進程后作用,以及涉及信號通路。我們證明,ROS抑制以后,小鼠卵母細胞減數(shù)分裂進程變慢,豬卵母細胞減數(shù)分裂進程變快。抑制期間,豬卵母細胞Cyclin B量逐漸增加,而小鼠卵母細胞Cyclin B量先降低后緩慢升高。在小鼠和豬上,(a)有活性CDC2A變化和Cyclin B變化類似,無活性CDC2A都是逐漸減少；(b)抑制期間添加CHX后,Cyclin B和有活性CDC2A都降低到最低,卵母細胞減數(shù)分裂進程顯著變慢；(c)抑制期間添加釩酸鈉使卵母細胞減數(shù)分裂進程變慢,添加EGF使進程加快,但都不影響Cyclin B變化。因此,ROS抑制卵母細胞3VBD期間,EGF能促進前MPF向MPF轉化,加速減數(shù)分裂進程。小鼠和豬卵母細胞抑制后減數(shù)分裂進程不同主要由于Cyclin B變化不同造成的,在前MPF向MPF轉化和EGF信號通路方面沒有差異。PART II:大鼠卵母細胞具有自發(fā)激活的特性,使大鼠體細胞核移植克隆非常困難,體外成熟卵母細胞自發(fā)激活比例顯著低于體內(nèi)成熟卵母細胞。關于大鼠卵母細胞研究主要集中在體內(nèi),不管是孤雌激活后發(fā)育還是體外受精后發(fā)育,關于體外成熟卵母細胞的研究很少,受精后有活體出生的報道更少。我們以成熟199為培養(yǎng)液,添加胱氨酸半胱胺,并且與卵丘共培養(yǎng)后顯著改善體外成熟卵母細胞質(zhì)量。卵母細胞孤雌激活和體外受精后發(fā)育能力都達到體內(nèi)成熟卵母細胞水平,將得到2-Cell胚胎移植后,胎兒出生率與體內(nèi)組無顯著差異。改善體外培養(yǎng)條件后,卵母細胞核進程和皮質(zhì)顆粒分布變化與體內(nèi)組更相近；卵母細胞抵抗氧化應激能力提高,ROS水平降低,GSH含量提高；促進發(fā)育相關基因表達,最終顯著改善卵母細胞胞質(zhì)成熟質(zhì)量。因此,我們建立一個比較好的大鼠體外成熟系統(tǒng),為將來進一步研究大鼠體外成熟卵母細胞特性及應用奠定了很好基礎。
【關鍵詞】：卵母細胞 GVBD 后作用 MPF 體外成熟 氧化應激
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q492
【目錄】：

• 中文摘要10-11
• Abstract11-13
• PARTⅠ 卵母細胞GVBD抑制對減數(shù)分裂進程后作用13-39
• 1 前言13-25
• 1.1 減數(shù)分裂恢復調(diào)控13-17
• 1.1.1 MPF與減數(shù)分裂13-15
• 1.1.2 MAPK與減數(shù)分裂15-17
• 1.2 不同抑制劑抑制減數(shù)分裂恢復17-20
• 1.2.1 蛋白磷酸化抑制劑17-18
• 1.2.2 蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX18-19
• 1.2.3 提高卵母細胞內(nèi)cAMP水平19-20
• 1.3 抑制減數(shù)分裂恢復對卵母細胞影響20-23
• 1.3.1 核進程變化20-21
• 1.3.2 蛋白和mRNA變化21-23
• 1.4 EGF對減數(shù)分裂作用23
• 1.5 本文主要研究內(nèi)容23-25
• 2 材料與方法25-28
• 2.1 主要試劑及配制25-26
• 2.2 實驗動物飼養(yǎng)及處理26
• 2.3 小鼠和豬卵母細胞收集26
• 2.4 卵母細胞體外培養(yǎng)26
• 2.5 減數(shù)分裂進程觀察26-27
• 2.6 Western雜交27
• 2.7 抗體選擇27
• 2.8 數(shù)據(jù)分析27-28
• 3 結果28-35
• 3.1 ROS抑制后,加速豬卵母細胞減數(shù)分裂進程,減緩小鼠卵母細胞減數(shù)分裂進程28-29
• 3.2 Western blot分析小鼠和豬卵母細胞抑制后cyclin B,總CDC2A,無活性和有活性P-CDC2A變化】29-30
• 3.3 抑制期間MPF組分變化與減數(shù)分裂進程的關系30-31
• 3.4 抑制過程中添加釩酸鈉減慢小鼠和豬卵母細胞減數(shù)分裂進程31-33
• 3.5 抑制期間通過添加EGF促進前MPF向MPF轉化加速小鼠和豬卵母細胞減數(shù)分裂進程33
• 3.6 抑制期間EGF對小鼠和豬卵母細胞cyclin B,無活性和有活性P-CDC2A影響33-35
• 4 討論35-38
• 4.1 抑制過程中cyclin B蛋白變化35
• 4.2 抑制過程中前MPF向MPF轉化35-36
• 4.3 抑制過程中添加EGF作用36-38
• 5 結論38-39
• PARTⅡ大鼠卵母細胞體外成熟系統(tǒng)優(yōu)化39-71
• 1 前言39-54
• 1.1 大鼠卵母細胞自發(fā)激活39-41
• 1.1.1 自發(fā)激活的影響因素40
• 1.1.2 自發(fā)激活的判定標準40-41
• 1.1.3 抑制大鼠卵母細胞自發(fā)激活的方法41
• 1.1.4 自發(fā)激活對胚胎發(fā)育及核移植克隆的影響41
• 1.2 卵母細胞體外成熟41-43
• 1.2.1 細胞質(zhì)成熟和核成熟42
• 1.2.2 卵母細胞體外成熟42-43
• 1.3 影響體外培養(yǎng)成熟的因素43-46
• 1.3.1 體外成熟的培養(yǎng)液43
• 1.3.2 卵丘細胞的影響43-44
• 1.3.3 氧化應激對卵母細胞體外成熟的影響44
• 1.3.4 卵泡直徑與卵母細胞直徑對卵母細胞體外成熟的影響44-45
• 1.3.5 動物年齡的影響45-46
• 1.4 提高體外成熟的卵母細胞的質(zhì)量方法46-49
• 1.4.1 抑制體外自發(fā)成熟46-47
• 1.4.2 卵丘共培養(yǎng)47-48
• 1.4.3 添加胱氨酸/半胱胺48-49
• 1.4.4 添加外源性卵分泌生長因子49
• 1.5 卵母細胞體外成熟質(zhì)量的檢測指標49-53
• 1.5.1 卵母細胞的形態(tài)學檢測49-50
• 1.5.2 減數(shù)分裂進程與卵母細胞體外成熟50
• 1.5.3 卵母細胞內(nèi)細胞器檢測50-51
• 1.5.4 體外胚胎發(fā)育51-52
• 1.5.5 卵母細胞胞質(zhì)中谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平52
• 1.5.6 發(fā)育相關基因檢測52-53
• 1.6 本文主要研究內(nèi)容53-54
• 2 材料與方法54-59
• 2.1 主要試劑及配制54
• 2.2 實驗動物及卵母細胞獲取54-55
• 2.3 卵母細胞體外成熟培養(yǎng)55
• 2.4 卵母細胞孤雌激活及胚胎培養(yǎng)55
• 2.5 卵母細胞體外受精55-56
• 2.6 卵母細胞自發(fā)激活判定56
• 2.7 胚胎移植56
• 2.7.1 制作不育雄鼠的輸精管切除術56
• 2.7.2 受體母鼠準備及胚胎移植56
• 2.8 核進程觀察56-57
• 2.9 皮質(zhì)顆粒染色57
• 2.10 卵母細胞內(nèi)ROS水平的檢測57
• 2.11 GSH水平檢測57-58
• 2.12 發(fā)育相關基因檢測58
• 2.13 數(shù)據(jù)分析58-59
• 3 結果59-67
• 3.1 不同成熟條件對卵母細胞核進程影響59
• 3.2 不同成熟條件對卵母細胞自發(fā)激活影響59-60
• 3.3 不同成熟條件對卵母細胞孤雌激活后胚胎發(fā)育影響60-61
• 3.4 不同成熟條件對卵母細胞體外受精后胚胎發(fā)育影響61-62
• 3.4.1 體外受精時獲能液摸索61
• 3.4.2 體外受精時獲能時間確定61-62
• 3.4.3 不同成熟條件對大鼠體外受精后胚胎發(fā)育能力影響62
• 3.5 不同成熟條件對胚胎著床后發(fā)育影響62-63
• 3.6 不同成熟條件對卵母細胞ROS水平影響63
• 3.7 不同成熟條件對卵母細胞谷胱甘肽水平影響63-64
• 3.8 不同成熟條件對卵母細胞成熟過程中皮質(zhì)顆粒分布影響64-65
• 3.9 不同成熟條件對發(fā)育相關基因表達的影響65-67
• 4 討論67-70
• 4.1 添加胱氨酸、半胱胺及卵丘共培養(yǎng)對胞質(zhì)成熟影響67
• 4.2 大鼠卵母細胞體外成熟后胚胎移植67-68
• 4.3 胞質(zhì)成熟相關指標68-69
• 4.4 大鼠體外受精條件優(yōu)化69-70
• 5 結論70-71
• References of part Ⅰ71-82
• References of part Ⅱ82-96
• 致謝96-97
• Publication List97

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