【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的造成全球養(yǎng)豬業(yè)嚴重危害的病毒性傳染病,主要臨床表現(xiàn)為妊娠母豬明顯的繁殖障礙以及仔豬嚴重的呼吸系統(tǒng)癥狀和生長遲緩。自1987年首次在北美發(fā)現(xiàn)以來,目前已擴散至全球各大養(yǎng)豬國,并造成了巨大的經(jīng)濟損失,也成為我國重要的地方流行性疾病之一。目前已知PRRSV誘導炎癥因子的大量表達和釋放某些蛋白質(zhì)參與免疫炎癥反應(yīng),例如PRRSV感染Marc-145細胞和豬肺泡巨噬細胞(PAMs)能誘導高遷移率族蛋白1(HMGB1)的釋放,且能增強PRRSV誘導的炎癥反應(yīng)。這提示我們細胞外分泌蛋白也在PRRSV的致病機理中發(fā)揮很重要的作用。但目前研究都僅基于對個別已知分泌蛋白的分析,無法對未知分泌蛋白進行分析且缺乏整體性。本研究利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析了PRRSV感染Marc-145細胞和未感染狀態(tài)下分泌蛋白圖譜的差異,通過生物信息學手段對差異蛋白表達譜進行分析并在功能上驗證差異蛋白PRDX3的促炎性因子作用和增強PRRSV誘導炎癥反應(yīng)的作用。具體研究內(nèi)容如下:1.PRRSV感染Marc-145細胞的分泌蛋白質(zhì)組學研究利用細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記(stable isotope labeling with amino acids in cell cultures,SILAC)技術(shù),配合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS),對PRRSV感染Marc-145細胞的分泌蛋白表達情況進行了定量檢測和分析。共鑒定出204個差異表達蛋白,包括163個表達上調(diào)的蛋白和41個表達下調(diào)的蛋白。隨后利用生物信息學技術(shù)對差異表達分泌蛋白的亞細胞定位、生物學功能進行了分析,并繪制了互作網(wǎng)絡(luò)圖,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染顯著激活了非經(jīng)典分泌途徑,特別是Exosome介導途徑,例如各種DAMPs的釋放。生物學功能分析發(fā)現(xiàn)差異表達的蛋白與蛋白結(jié)合和轉(zhuǎn)運、應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控、代謝過程和免疫反應(yīng)等多種生物過程相關(guān)。為了驗證分泌蛋白質(zhì)組學結(jié)果的可靠性,進一步通過Western blot方法對結(jié)果中的4個差異表達的蛋白進行了檢測,結(jié)果與蛋白質(zhì)組學結(jié)果一致。2.PRDX3誘導炎癥因子的表達過氧化物酶(peroxiredoxins,Prxs)是一類很重要的內(nèi)源性抗氧化劑。已有報道顯示,細胞外的PRDX1作為促炎性因子與TLR4結(jié)合,激活NF-κB,促進TNF-α和IL-6的分泌。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后促進了PRDX3的分泌,繼而對其可能的促炎性因子作用進行了研究。首先原核表達和純化PRDX3,隨后處理PK-15細胞,通過NF-κB熒光素酶報告系統(tǒng)、Western blot實驗、間接免疫熒光和相對定量PCR發(fā)現(xiàn),PRDX3可以誘導NF-κB的激活、NF-κB p65亞基的磷酸化和入核、IL-6,IL-8和TNF-α等炎癥因子的表達,說明PRDX3具有促炎性因子的作用。為了探討TLR4是否參與PRDX3誘導的炎癥反應(yīng),將TLR4干擾分子轉(zhuǎn)染PK-15細胞后用PRDX3蛋白處理,通過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)干擾TLR4的表達能抑制PRDX3誘導的IL-6,IL-8和TNF-α等炎癥因子的表達。此外,利用PRDX3處理TLR4缺失的HEK-293T細胞則不能誘導NF-κB的激活,而在轉(zhuǎn)染了TLR4超表達質(zhì)粒的HEK-293T細胞上PRDX3可以誘導NF-κB的激活。以上結(jié)果提示TLR4參與PRDX3誘導的炎癥反應(yīng)。3.PRDX3參與PRRSV誘導的NF-κB激活和炎癥因子的表達首先,利用間接免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染Marc-145細胞后,不能改變PRDX3的線粒體定位。隨后采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染能誘導細胞上清中PRDX3的表達,而胞內(nèi)PRDX3則略微下調(diào)。由于PRRSV感染顯著激活了Exosome介導的蛋白分泌途徑和會引起細胞線粒體損傷,溶解,我們推測Exosome在PRRSV誘導PRDX3的分泌中具有重要的作用。隨后,我們檢測發(fā)現(xiàn)PRDX3不影響PRRSV的增殖。但將純化的PRDX3蛋白處理Marc-145細胞,通過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)胞外PRDX3能上調(diào)PRRSV誘導的IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子的表達。將PRDX3干擾分子轉(zhuǎn)染Marc-145細胞后接種PRRSV,干擾內(nèi)源性的PRDX3促進PRRSV誘導的IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子的表達,推測胞內(nèi)的PRDX3可能通過其過氧化物酶活性影響ROS介導的炎癥反應(yīng)。以上結(jié)果提示胞內(nèi)和胞外的PRDX3在PRRSV誘導的炎癥反應(yīng)中扮演重要角色。
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華中農(nóng)業(yè)大學 2016 屆博士研究生學位論文研究（galectin-1）(Cooper and Barondes 1990)發(fā)現(xiàn)并建立起來的。此后，通過非途徑分泌的蛋白已包括到激素、生長因子、細胞因子、趨化因子、病毒蛋白質(zhì)生蟲蛋白質(zhì)。研究者至少發(fā)現(xiàn)了 4 種形式的非經(jīng)典分泌途徑(Koomen et al 200種形式的非經(jīng)典分泌途徑是將目的蛋白轉(zhuǎn)運到各種類型的囊泡中，包括內(nèi)吞作分泌溶酶體（endocytic secretory lysosomes）（圖 1-1B，步驟 2）、衍生出外泌體exosome）的多囊泡體（multivesicular bodies，MVBs）（圖 1-1B，步驟 3）和從表面分離的各種微泡（microvesicles）（圖 1-1B，步驟 4）。還有一種非經(jīng)典分泌是不通過囊泡的而是直接轉(zhuǎn)運細胞質(zhì)蛋白到細胞質(zhì)膜（圖 1-1B，步驟 5），例如原細胞生長因子（FGF-2）的分泌就是不通過運輸小泡，直接跨膜外運到胞外一種被動擴散的過程(Seelenmeyer et al 2008)。

除了以上介紹的分泌蛋白樣品制備和分離鑒定技術(shù)外，各種生物學軟件也蛋白質(zhì)組的研究提供了非常好的工具，大大加速了分泌蛋白質(zhì)組的研究。蛋以通過這些生物學軟件，例如常用信號肽預(yù)測軟件 SignalP(Bendtsen et al 2004SORT(Hiller et al 2004a)、TargetP 和跨膜區(qū)預(yù)測軟件 TMHMM 等，對其信號肽區(qū)進行分析可以確定備選的分泌蛋白。SecretomeP 除了可以準確的預(yù)測含有的經(jīng)典分泌蛋白，也可以預(yù)測不含有信號肽的非經(jīng)典分泌的蛋白質(zhì)(Bendtsen 004a)。利用分泌蛋白質(zhì)組學技術(shù)鑒定或生物學軟件預(yù)測到的分泌蛋白后，可白質(zhì)印跡法（Western blot）、免疫組化 （Immunohistochemistry）、間接免疫疫熒光（Immunofluorescence technique）等技術(shù)對分泌蛋白的定位和功能進行研外還有可以采用酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid system）、GST-pull-down ass疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）及蛋白質(zhì)芯片（protein chip）等蛋白質(zhì)的相互作用進行研究，，為分泌蛋白質(zhì)組學的結(jié)果提供更好的驗證。圖 1-2 分泌蛋白質(zhì)組研究策略(Deshmukh et al 2015)Fig. 1-2 Research strategy for secretome
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.651

【參考文獻】

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1 汪銘書;程安春;劉伍梅;周毅;郭宇飛;袁桂萍;陳孝躍;;豬生殖與呼吸綜合征病毒感染Marc-145細胞的病毒形態(tài)發(fā)生和細胞超微結(jié)構(gòu)觀察[J];病毒學報;2007年01期

本文編號：2654240