發(fā)布時間：2020-05-08 06:03

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的造成全球養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重危害的病毒性傳染病,主要臨床表現(xiàn)為妊娠母豬明顯的繁殖障礙以及仔豬嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)癥狀和生長遲緩。自1987年首次在北美發(fā)現(xiàn)以來,目前已擴(kuò)散至全球各大養(yǎng)豬國,并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,也成為我國重要的地方流行性疾病之一。目前已知PRRSV誘導(dǎo)炎癥因子的大量表達(dá)和釋放某些蛋白質(zhì)參與免疫炎癥反應(yīng),例如PRRSV感染Marc-145細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)能誘導(dǎo)高遷移率族蛋白1(HMGB1)的釋放,且能增強(qiáng)PRRSV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。這提示我們細(xì)胞外分泌蛋白也在PRRSV的致病機(jī)理中發(fā)揮很重要的作用。但目前研究都僅基于對個別已知分泌蛋白的分析,無法對未知分泌蛋白進(jìn)行分析且缺乏整體性。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了PRRSV感染Marc-145細(xì)胞和未感染狀態(tài)下分泌蛋白圖譜的差異,通過生物信息學(xué)手段對差異蛋白表達(dá)譜進(jìn)行分析并在功能上驗(yàn)證差異蛋白PRDX3的促炎性因子作用和增強(qiáng)PRRSV誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用。具體研究內(nèi)容如下:1.PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究利用細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記(stable isotope labeling with amino acids in cell cultures,SILAC)技術(shù),配合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS),對PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的分泌蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了定量檢測和分析。共鑒定出204個差異表達(dá)蛋白,包括163個表達(dá)上調(diào)的蛋白和41個表達(dá)下調(diào)的蛋白。隨后利用生物信息學(xué)技術(shù)對差異表達(dá)分泌蛋白的亞細(xì)胞定位、生物學(xué)功能進(jìn)行了分析,并繪制了互作網(wǎng)絡(luò)圖,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染顯著激活了非經(jīng)典分泌途徑,特別是Exosome介導(dǎo)途徑,例如各種DAMPs的釋放。生物學(xué)功能分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白與蛋白結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)、應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控、代謝過程和免疫反應(yīng)等多種生物過程相關(guān)。為了驗(yàn)證分泌蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性,進(jìn)一步通過Western blot方法對結(jié)果中的4個差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行了檢測,結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。2.PRDX3誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)過氧化物酶(peroxiredoxins,Prxs)是一類很重要的內(nèi)源性抗氧化劑。已有報(bào)道顯示,細(xì)胞外的PRDX1作為促炎性因子與TLR4結(jié)合,激活NF-κB,促進(jìn)TNF-α和IL-6的分泌。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后促進(jìn)了PRDX3的分泌,繼而對其可能的促炎性因子作用進(jìn)行了研究。首先原核表達(dá)和純化PRDX3,隨后處理PK-15細(xì)胞,通過NF-κB熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、Western blot實(shí)驗(yàn)、間接免疫熒光和相對定量PCR發(fā)現(xiàn),PRDX3可以誘導(dǎo)NF-κB的激活、NF-κB p65亞基的磷酸化和入核、IL-6,IL-8和TNF-α等炎癥因子的表達(dá),說明PRDX3具有促炎性因子的作用。為了探討TLR4是否參與PRDX3誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),將TLR4干擾分子轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后用PRDX3蛋白處理,通過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)干擾TLR4的表達(dá)能抑制PRDX3誘導(dǎo)的IL-6,IL-8和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。此外,利用PRDX3處理TLR4缺失的HEK-293T細(xì)胞則不能誘導(dǎo)NF-κB的激活,而在轉(zhuǎn)染了TLR4超表達(dá)質(zhì)粒的HEK-293T細(xì)胞上PRDX3可以誘導(dǎo)NF-κB的激活。以上結(jié)果提示TLR4參與PRDX3誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。3.PRDX3參與PRRSV誘導(dǎo)的NF-κB激活和炎癥因子的表達(dá)首先,利用間接免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后,不能改變PRDX3的線粒體定位。隨后采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染能誘導(dǎo)細(xì)胞上清中PRDX3的表達(dá),而胞內(nèi)PRDX3則略微下調(diào)。由于PRRSV感染顯著激活了Exosome介導(dǎo)的蛋白分泌途徑和會引起細(xì)胞線粒體損傷,溶解,我們推測Exosome在PRRSV誘導(dǎo)PRDX3的分泌中具有重要的作用。隨后,我們檢測發(fā)現(xiàn)PRDX3不影響PRRSV的增殖。但將純化的PRDX3蛋白處理Marc-145細(xì)胞,通過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)胞外PRDX3能上調(diào)PRRSV誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。將PRDX3干擾分子轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞后接種PRRSV,干擾內(nèi)源性的PRDX3促進(jìn)PRRSV誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子的表達(dá),推測胞內(nèi)的PRDX3可能通過其過氧化物酶活性影響ROS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。以上結(jié)果提示胞內(nèi)和胞外的PRDX3在PRRSV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中扮演重要角色。
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016 屆博士研究生學(xué)位論文研究（galectin-1）(Cooper and Barondes 1990)發(fā)現(xiàn)并建立起來的。此后，通過非途徑分泌的蛋白已包括到激素、生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、病毒蛋白質(zhì)生蟲蛋白質(zhì)。研究者至少發(fā)現(xiàn)了 4 種形式的非經(jīng)典分泌途徑(Koomen et al 200種形式的非經(jīng)典分泌途徑是將目的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到各種類型的囊泡中，包括內(nèi)吞作分泌溶酶體（endocytic secretory lysosomes）（圖 1-1B，步驟 2）、衍生出外泌體exosome）的多囊泡體（multivesicular bodies，MVBs）（圖 1-1B，步驟 3）和從表面分離的各種微泡（microvesicles）（圖 1-1B，步驟 4）。還有一種非經(jīng)典分泌是不通過囊泡的而是直接轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞質(zhì)蛋白到細(xì)胞質(zhì)膜（圖 1-1B，步驟 5），例如原細(xì)胞生長因子（FGF-2）的分泌就是不通過運(yùn)輸小泡，直接跨膜外運(yùn)到胞外一種被動擴(kuò)散的過程(Seelenmeyer et al 2008)。

除了以上介紹的分泌蛋白樣品制備和分離鑒定技術(shù)外，各種生物學(xué)軟件也蛋白質(zhì)組的研究提供了非常好的工具，大大加速了分泌蛋白質(zhì)組的研究。蛋以通過這些生物學(xué)軟件，例如常用信號肽預(yù)測軟件 SignalP(Bendtsen et al 2004SORT(Hiller et al 2004a)、TargetP 和跨膜區(qū)預(yù)測軟件 TMHMM 等，對其信號肽區(qū)進(jìn)行分析可以確定備選的分泌蛋白。SecretomeP 除了可以準(zhǔn)確的預(yù)測含有的經(jīng)典分泌蛋白，也可以預(yù)測不含有信號肽的非經(jīng)典分泌的蛋白質(zhì)(Bendtsen 004a)。利用分泌蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定或生物學(xué)軟件預(yù)測到的分泌蛋白后，可白質(zhì)印跡法（Western blot）、免疫組化 （Immunohistochemistry）、間接免疫疫熒光（Immunofluorescence technique）等技術(shù)對分泌蛋白的定位和功能進(jìn)行研外還有可以采用酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid system）、GST-pull-down ass疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）及蛋白質(zhì)芯片（protein chip）等蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行研究，，為分泌蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果提供更好的驗(yàn)證。圖 1-2 分泌蛋白質(zhì)組研究策略(Deshmukh et al 2015)Fig. 1-2 Research strategy for secretome
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.651

【參考文獻(xiàn)】

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1 汪銘書;程安春;劉伍梅;周毅;郭宇飛;袁桂萍;陳孝躍;;豬生殖與呼吸綜合征病毒感染Marc-145細(xì)胞的病毒形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察[J];病毒學(xué)報(bào);2007年01期

本文編號：2654240