本文關(guān)鍵詞：枸杞β-胡蘿卜素羥化酶基因及其啟動子的克隆和研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：類胡蘿卜素是一類天然的脂溶性色素,在真菌、細菌和植物中都有類胡蘿卜素的存在。類胡蘿卜素還是一種重要的光合色素,它一般廣泛地位于光合組織中。在光合組織中,類胡蘿卜素可以淬滅活性氧和保護DNA免受損傷。玉米黃質(zhì)是一種葉黃素,它是由β-胡蘿卜素羥化酶催化β-胡蘿卜素產(chǎn)生的。枸杞是一種傳統(tǒng)的中草藥,具有很多重要的生物功能,例如抗癌、抗衰老、抗氧化。然而,目前還沒有關(guān)于枸杞中β-胡蘿卜素羥化酶的報道。本研究克隆了枸杞β-胡蘿卜素羥化酶基因,通過生物信息學深入分析了枸杞β-胡蘿卜素羥化酶的特點,并將該基因轉(zhuǎn)入煙草進行表達,研究了該基因在植物抵抗非生物逆境中的生物學功能。首先,利用3'-cDNA末端快速擴增技術(shù)(3'-RACE),克隆了枸杞中β-胡蘿卜素羥化酶基因(chyb)的開放閱讀框。枸杞chyb基因全長939 bp,編碼的CHYB蛋白分子量為34.8 kDa,預(yù)測其等電點為8.36。生物信息學分析表明,枸杞CHYB蛋白定位于葉綠體。為了進一步分析枸杞CHYB的催化功能,本研究在大腸桿菌細胞內(nèi)進行了功能互補分析實驗。從結(jié)果可以看出,枸杞CHYB可以催化β-胡蘿卜素發(fā)生反應(yīng)生成玉米黃質(zhì),為生物合成玉米黃質(zhì)提供了新的途徑。然后,本文研究了枸杞chyb基因在植物中的功能。在轉(zhuǎn)基因煙草中,檢測到葉黃素循環(huán)池容量明顯增加,這與β-胡蘿卜素羥化酶催化產(chǎn)生玉米黃質(zhì)是分不開的。在滲透脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因煙草的根長和生物量明顯地高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M。在干旱脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因煙草的葉片失水速度比非轉(zhuǎn)基因的慢,光合速率和SOD活性明顯較高,而氣孔導度和丙二醛含量明顯較低。在鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠素和脯氨酸含量明顯地高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M,而丙二醛含量和Na+/K+明顯地較低。通過以上研究結(jié)果表明,枸杞chyb基因在煙草中表達,增加了葉黃素循環(huán)池的容量,從而使轉(zhuǎn)基因煙草具有抵抗干旱逆境和鹽漬逆境的能力,為植物耐旱和耐鹽分子育種提供了重要的備選基因。最后,為了研究枸杞chyb基因啟動子在調(diào)控基因表達方面的作用,本研究克隆了枸杞chyb基因的啟動子chybpro。生物信息學分析結(jié)果表明,在枸杞chybpro序列中存在多個光響應(yīng)元件和胚乳特異性表達元件,為植物光響應(yīng)和胚乳特異性表達提供了新的啟動子。
【關(guān)鍵詞】：枸杞 類胡蘿卜素 β-胡蘿卜素羥化酶 玉米黃質(zhì) 煙草
【學位授予單位】：天津大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-12
• 第一章 緒論12-28
• 1.1 類胡蘿卜素理化特性12-14
• 1.1.1 類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)特性12
• 1.1.2 類胡蘿卜素多烯鏈中獨特的電子云分布12-13
• 1.1.3 多樣的類胡蘿卜素氧化裂解反應(yīng)13-14
• 1.2 類胡蘿卜素的生物合成14-18
• 1.2.1 萜類化合物的生物合成14
• 1.2.2 植物細胞質(zhì)體中的非甲羥戊酸途徑14-15
• 1.2.3 高等植物類胡蘿卜素的生物合成15-17
• 1.2.4 含氧類胡蘿卜素衍生物的生物合成17-18
• 1.3 類胡蘿卜素生物合成途徑的調(diào)節(jié)控制及其基因工程研究18-21
• 1.3.1 類胡蘿卜素生物合成途徑的調(diào)節(jié)控制18-19
• 1.3.2 類胡蘿卜素代謝途徑的基因工程研究19-21
• 1.4 植物類胡蘿卜素生物學功能21-22
• 1.5 β-胡蘿卜素羥化酶的生物學功能22-23
• 1.5.1 β-胡蘿卜素羥化酶在抵抗干旱逆境中的作用22-23
• 1.5.2 β-胡蘿卜素羥化酶在抵抗強光照射中的作用23
• 1.6 枸杞 β-胡蘿卜素羥化酶基因啟動子的研究23-24
• 1.7 植物的遺傳轉(zhuǎn)化方法研究24-25
• 1.8 本研究的目的意義、研究內(nèi)容與技術(shù)路線25-28
• 1.8.1 本研究的目的意義25-26
• 1.8.2 研究內(nèi)容26
• 1.8.3 技術(shù)路線26-28
• 第二章 枸杞chyb基因的克隆及生物信息學分析28-44
• 2.1 實驗材料與儀器設(shè)備28-30
• 2.1.1 植物材料28
• 2.1.2 質(zhì)粒及菌株28
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備28-29
• 2.1.4 本研究所用的培養(yǎng)基29
• 2.1.5 本研究所用的主要試劑及貯液29-30
• 2.2 實驗方法30-37
• 2.2.1 引物設(shè)計與DNA序列測序30-31
• 2.2.2 CaCl_2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞31
• 2.2.3 熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌31
• 2.2.4 質(zhì)粒的小量提取31-32
• 2.2.5 質(zhì)粒大量提取32
• 2.2.6 核酸瓊脂糖凝膠電泳32-33
• 2.2.7 DNA切膠回收與產(chǎn)物純化33
• 2.2.8 枸杞葉片總RNA提取33
• 2.2.9 3'-RACE克隆chyb基因33-34
• 2.2.10 chyb基因克隆載體構(gòu)建34-35
• 2.2.11 連接產(chǎn)物的驗證35-36
• 2.2.12 生物信息學分析36
• 2.2.13 枸杞chyb基因轉(zhuǎn)錄水平分析36-37
• 2.3 結(jié)果與分析37-42
• 2.3.1 枸杞葉片總RNA的提取37
• 2.3.2 chyb基因的克隆與分析37-39
• 2.3.3 枸杞CHYB特性39-40
• 2.3.4 枸杞CHYB結(jié)構(gòu)分析40-41
• 2.3.5 枸杞CHYB蛋白進化分析41-42
• 2.3.6 枸杞chyb基因組織特異型表達分析42
• 2.4 討論42-43
• 2.5 小結(jié)43-44
• 第三章 枸杞chyb基因在大腸桿菌中的表達44-54
• 3.1 實驗材料44-45
• 3.1.1 載體和菌株44
• 3.1.2 主要儀器44-45
• 3.1.3 本研究所用主要試劑及貯液45
• 3.1.4 本研究所用的培養(yǎng)基45
• 3.2 實驗方法45-49
• 3.2.1 大腸桿菌表達載體pET-28a-chyb的構(gòu)建45-47
• 3.2.2 pET-28a-chyb與互補質(zhì)粒pACCAR16ΔcrtX的共轉(zhuǎn)化47
• 3.2.3 誘導表達47
• 3.2.4 重組蛋白的分離純化47-48
• 3.2.5 重組蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測48-49
• 3.2.6 類胡蘿卜素的提取49
• 3.2.7 類胡蘿卜素的高壓液相色譜（HPLC）檢測49
• 3.3 結(jié)果與分析49-52
• 3.3.1 大腸桿菌表達載體pET-28a-chyb的構(gòu)建49-50
• 3.3.2 枸杞chyb基因在大腸桿菌中的表達50-51
• 3.3.3 枸杞chyb基因在大腸桿菌中的功能互補分析51-52
• 3.4 討論52-53
• 3.5 小結(jié)53-54
• 第四章 異源表達枸杞chyb基因提高煙草抵抗非生物逆境的研究54-76
• 4.1 實驗材料54-57
• 4.1.1 植物材料54
• 4.1.2 質(zhì)粒和菌株54
• 4.1.3 主要儀器54-55
• 4.1.4 主要試劑55-56
• 4.1.5 實驗所用培養(yǎng)基56-57
• 4.2 實驗方法57-66
• 4.2.1 大腸桿菌表達載體pCAMBIA2300-chyb構(gòu)建57-59
• 4.2.2 煙草葉盤轉(zhuǎn)化方法59-60
• 4.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草分子檢測60-62
• 4.2.4 煙草類胡蘿卜素的含量測定62-63
• 4.2.5 煙草葉片脫落酸（ABA）含量測定63
• 4.2.6 脯氨酸含量測定63-64
• 4.2.7 SOD含量的測定64-65
• 4.2.8 MDA含量的測定65
• 4.2.9 Na~+、K~+含量測定65
• 4.2.10 葉綠素含量測定65-66
• 4.2.11 逆境處理與生理指標測定66
• 4.3 結(jié)果與分析66-73
• 4.3.1 轉(zhuǎn)基因煙草的外源基因整合與表達分析66-68
• 4.3.2 轉(zhuǎn)基因煙草對于滲透脅迫的耐受性68
• 4.3.3 轉(zhuǎn)基因煙草中類胡蘿卜素與ABA的含量68-69
• 4.3.4 枸杞chyb基因在干旱脅迫條件下的作用69-71
• 4.3.5 鹽脅迫下煙草細胞內(nèi)Na~+/K~+、脯氨酸、MDA、葉綠素含量的測定71-73
• 4.4 討論73-75
• 4.5 小結(jié)75-76
• 第五章 枸杞chyb基因啟動子的克隆及其功能分析76-93
• 5.1 實驗材料76-77
• 5.1.1 植物材料76
• 5.1.2 質(zhì)粒和菌株76
• 5.1.3 主要儀器76-77
• 5.1.4 主要試劑77
• 5.1.5 所用培養(yǎng)基77
• 5.2 實驗方法77-84
• 5.2.1 枸杞chyb啟動子的克隆77-80
• 5.2.2 高效連接啟動子的植物基因工程載體構(gòu)建方法80-83
• 5.2.3 枸杞chybpro與pJWW0230連接83
• 5.2.4 載體pJWW0230-chybpro與GFP熒光蛋白基因的連接83
• 5.2.5 煙草葉片瞬時表達83-84
• 5.3 結(jié)果與分析84-90
• 5.3.1 枸杞基因組提取結(jié)果84
• 5.3.2 枸杞chybpro的克隆84-86
• 5.3.3 枸杞chybpro的生物信息學分析86-87
• 5.3.4 高效連接啟動子的植物基因工程載體構(gòu)建及枸杞chybpro的功能鑒定87-90
• 5.4 討論90-92
• 5.4.1 TAIL-PCR技術(shù)的應(yīng)用前景90-91
• 5.4.2 枸杞chybpro啟動子功能及應(yīng)用91
• 5.4.3 植物基因工程表達載體pJWW0230的應(yīng)用91-92
• 5.5 小結(jié)92-93
• 第六章 結(jié)論與展望93-96
• 6.1 研究總結(jié)93-94
• 6.2 創(chuàng)新點94
• 6.3 展望94-96
• 參考文獻96-106
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明106-108
• 致謝108-109

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 朱秀靈,車振明,徐偉,焦云鵬,熊華;β-胡蘿卜素的生理功能及其提取技術(shù)的研究進展[J];廣州食品工業(yè)科技;2004年02期

2 陸磊;;農(nóng)產(chǎn)品中β-胡蘿卜素檢測方法的應(yīng)用與研究[J];甘肅科技;2009年23期

3 莫苑宏;給β胡蘿卜素畫句號[J];全球科技經(jīng)濟w，

本文編號：259266