【摘要】：Dynamitin(Dmn)又名DC7N2-p50,該基因編碼動力蛋白激活蛋白(dynactin)的核心亞基Dmn, Dmn是dynactin復合體聚合以及連接Arp1纖維和側(cè)臂的關(guān)鍵因子,同時也是dynactin復合體與動力蛋白(dynein)和微管(tubulin)蛋白相連接的重要結(jié)構(gòu)。細胞中許多運動事件都是通過dynein-dynactin復合體來進行調(diào)節(jié)的。研究組已有研究結(jié)果顯示:一種內(nèi)共生菌Wolbachia感染,導致果蠅產(chǎn)生細胞質(zhì)不親和(CI)表型,即感染W(wǎng)olbachia的雄性果蠅與未感染或者感染不同品系Wolbachia的雌性果蠅進行交配時,后代胚胎成活率顯著降低或沒有后代存活。為了深入探究果蠅感染W(wǎng)olbachia引起CI的分子機理,研究組通過microarry技術(shù)檢測了未感染和感染W(wǎng)olbachia的三齡幼蟲精巢中基因表達情況,共鑒定到296種差異表達的基因(差異倍數(shù)均在1.5倍以上),其中167個基因表達量上調(diào),129個基因表達量下調(diào)。研究組還通過比較蛋白組學,研究了與感染和未感染W(wǎng)olbachia的1日齡雄性交配2h后雌性受精囊和納精囊中的差異表達蛋白,鑒定到了 83個差異表達的蛋白。在microarey和蛋白組學檢測中,Dmn表達量在Wolbachia感染后均呈下調(diào)趨勢,暗示其可能在雄性果蠅的生殖過程中起重要作用,因此我們選用RNAi干擾品系,用UAS/Ga14系統(tǒng)驅(qū)動Dmn在果蠅中特異性敲降,以研究Dmn在雄性果蠅繁殖過程中的作用及與CI的關(guān)系。我們首先通過熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)的方法,驗證了Wolbachia感染對果蠅精巢中Dmn表達的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),wMelWolbachia感染確實引起果蠅精巢內(nèi)Dmn表達量極顯著下調(diào)(P0.01)。然后,通過用UAS/Ga14系統(tǒng),選用nosGa14驅(qū)動Dmn在果蠅性腺中敲降,探究Dmn在雄性果蠅繁殖過程中的作用。選取了兩個Dmn的干擾品系(干擾序列有差異):Dmn-hp-1和Dmn-hp-2,與nosGal4/TM6B處女蠅交配,得到Dmn在精巢中敲降的雄蠅nosGal4/Dmn-hp-1和nosGal4/Dmn-hp-2。再用Dmn在精巢中敲降的雄蠅與野生處女蠅交配后,統(tǒng)計胚胎的孵化率,結(jié)果顯示,胚胎孵化率分別為28.97 ±4.14%和42.34 ±4.40%,均極顯著低于對照組的90.64±3.32%,產(chǎn)生了類似Wolbachaa感染引起CI的表型。這一結(jié)果說明,Wolbachiia感染引起果蠅精巢內(nèi)Dmn表達量極顯著下調(diào),可能是Wolbachia感染引起CI的原因之一。為進一步研究Dmn在Wolbachia感染的果蠅精巢內(nèi)表達量下調(diào)是否與CI相關(guān),我們在Wolbachia感染的果蠅精巢內(nèi)過量表達Dmn,看其是否能挽救雄果蠅的育性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在Wolbachia感染的果蠅精巢內(nèi)過量表Dmn后,確實能夠挽救雄果蠅的育性,其子代胚胎孵化率恢復至77.84%,表明Wolbachia感染引起果蠅精巢內(nèi)Dmn表達量下調(diào),確實是引起CI的原因。為了研究Dmmn影響雄性果蠅育性的機制,我們采用免疫組化和透射電鏡技術(shù)對Dmn敲降精巢中精子發(fā)生過程進行分析(后續(xù)研究都用的是Dmn-hp-1品系)。DAPI染色顯示,與對照組相比,Dmn敲降精巢前端比較膨大,精巢基部精子束較少,且精子核濃縮程度低,在精子束周圍,還散布一些處于獨木舟階段的精細胞。在精巢末端,對照組分布有核高度濃縮成針形的精子,而在Dmn敲降組精子核還沒有高度濃縮就從包囊中脫離出來。在最后的儲精囊中,對照組充滿成熟的精子,而Dmn敲降組中精子較少,大約為對照組的40%,這表明Dmn在精巢中敲降破壞了精子發(fā)生過程,降低了精子的產(chǎn)生量,可能因而降低了雄性果蠅的育性。正常條件下,在果蠅精子發(fā)生的第二次成熟分裂末期,線粒體聚集、融合,將發(fā)育為線粒體衍生物,進而發(fā)育為副核(nebenkem)。透射電鏡結(jié)果顯示:在第二次成熟分裂末期,對照組精細胞中有許多線粒體聚集在一起,其中部分線粒體已開始融合,而Dmn敲降組精細胞中線粒體較少,且沒有聚集。之后,在精母細胞經(jīng)過2次成熟分裂形成64個圓形精細胞的包囊中,對照組精細胞排列整齊有序,每一個精細胞有一個大的線粒體衍生物靠近一個軸絲,而在Dmn敲降組精細胞的包囊中,精細胞排列較為混亂,經(jīng)常發(fā)現(xiàn)精細胞膜融合的現(xiàn)象,在一個細胞膜內(nèi)有多個軸絲——線粒體對,也觀察到有多個線粒體衍生物伴隨一個軸絲的現(xiàn)象。在精子伸長階段,在對照組包囊橫切面上可以觀察到,每一個精子都包含一個副核伴隨一個軸絲,排列方向一致,而在Dmn敲降組中,精子排列無序,有時可以觀察到,兩對軸絲——線粒體通過兩個連在一起的小的線粒體衍生物連在一起,部分副核沒有高度濃縮。在精子個體化階段,Dmn敲降組精細胞的包囊膜迅速內(nèi)陷,包囊中部分精子發(fā)生退化,這可能是未成熟精子過早從包囊中釋放且精子數(shù)量少的原因�？贵w染色顯示,Dmn在雄性生殖干細胞中沒有表達。當生殖干細胞開始分化,經(jīng)過四輪同步分裂形成16個精原細胞組成包囊時,Dmn開始表達。在對照組精母細胞分裂的前中期,在星狀體微管和紡錘體的兩極Dmn信號較強,在著絲粒處也有Dmn的表達,在這個過程中,dynein幾乎與Dmn共定位。而在Dmn敲降組精母細胞分裂的前中期,Dmn的信號強度顯著低于對照組(P0.05)。隨著精子的成熟,Dmn和dynein的信號逐漸減弱,最后消失,說明它們可能與多余的細胞質(zhì)一起被排出精子之外。Dmn敲降也導致精細胞中dynein和tubulin表達下降,這也可能是精子不能正常形成的原因。精子發(fā)生的最后步驟就是個體化過程和成熟精子的卷曲。個體化過程通過形成個體化復合體(individualization complex, IC)來完成。IC由64個環(huán)繞針狀精核的肌動蛋白(F-actin)椎體組成。在個體化過程中,IC從精子頭部沿著軸絲向精子尾部運動,去除多余的細胞質(zhì)和細胞器,每個精子之間形成新的細胞膜,完成精子個體化過程,形成獨立的有活力的成熟精子。在Dmn敲降精巢中,精子束結(jié)構(gòu)分散,且大部分精子束沒有形成完整有序的個體化復合體,在精巢中有散亂的F-actin分布。另外,與對照組相比,在Dmn敲降精巢中,個體化復合體沿著精子束移動的速度較慢,精子仍處于個體化的初期狀態(tài),仍有部分精子束沒有個體化復合體形成。這一結(jié)果表明,Dmn可調(diào)控F-actin的聚集以及IC的形成,因而影響精子個體化過程。由于Dmn敲降產(chǎn)生的部分表型與Lis-1、Spag4、Yuri、Ddlc1、DCTN1-p150和ATPsys-b等基因突變引起的表型相似,我們又通過qRT-PCR的方法檢測Dmn敲降對這些基因表達的影響,結(jié)果顯示,Dmn在果蠅精巢中敲降也引起這些基因在精巢中的表達顯著下調(diào)。為了研究這些基因是否與Dmn相互作用,我們選擇了 Ddlc1 (編碼果蠅的Dynein輕鏈)進行進一步探索。將Ddlc1在Dmn敲降的果蠅精巢中過量表達,檢測其是否能挽救由于Dmnn敲降引起雄性果蠅育性下降的表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ddlc1在Dmn敲降的果蠅精巢中過量表達的確能夠挽救由于Dmn敲降引起雄性果蠅育性缺陷,子代胚胎孵化率恢復至89.95±2.73%。因此,Dmn基因的確與這些精子發(fā)生相關(guān)基因之間存在相互作用關(guān)系,共同調(diào)控果蠅的精子發(fā)生過程。我們還選用actGa14驅(qū)動Dmn在果蠅全身廣泛敲降,來探究Dmn在果蠅發(fā)育過程中作用。結(jié)果顯示,Dmn在果蠅全身廣泛敲降后,導致敲果蠅只能發(fā)育至幼蟲階段,不能化蛹,并最終在幼蟲期死亡。根據(jù)相關(guān)文獻報道,影響果蠅幼蟲發(fā)育的信號通路主要是保幼激素信號通路和蛻皮激素信號通路。在本研究中,我們對幼蟲的蛻皮情況進行觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Dmn全身廣泛敲降的幼蟲蛻皮情況與對照組差異不顯著,因此,我們推測,Dmn敲降后可能影響了保幼激素信號通路。因此,我們檢測了與保幼激素相關(guān)的基因JhI-26、Met和Kr-h1在Dmn全身廣泛敲降的幼蟲中的表達量。結(jié)果顯示,3個基因的表達量均發(fā)生顯著上調(diào)。因此,我們推斷,Dmmn對幼蟲生長的影響是通過調(diào)控與保幼激素相關(guān)的基因JhO-26、Met和Kr-h1上調(diào)表達來誘導保幼激素過度表達,使幼蟲不能化蛹。綜上所述,Dmn不僅在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,而且在調(diào)控幼蟲的生長發(fā)育過程中也有重要的功能。本研究還發(fā)現(xiàn),Wolbachia感染引起果蠅精巢中Dmn表達下調(diào),是Wolbachia誘導昆蟲產(chǎn)生CI的機制之一。這不僅為精子發(fā)生的調(diào)控機制的研究提供了新的思路,而且由于果蠅的精子發(fā)生和人類的精子發(fā)生有很多相似之處,本研究也能夠為研究男性不育機制提供一定的基礎(chǔ)資料。
【圖文】：

Ａｒｐｌ纖維和側(cè)臂的決定性因素，同時也是ｄｙｎａｃｔｉｎ復合體與動力蛋白（ｄｙｎｅｉｎ）和微管（ｔｕｂｕｌｉｎ）逡逑蛋白相連接的重要結(jié)構(gòu)（Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，１９９６；邋Ｍａｉｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００８；邋Ｊａｃｑｕｏｔ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１０；邋Ｃｈｅｏｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２０１４），邋Ｄｍｎ在ｄｙｎａｃｔｉｎ復合體中的作用如圖１．１所示。逡逑廠逡逑Ｓｈｏｕｌｄｅｒ／邋／逡逑Ｓｉｄｅａｒｍ邋／邐ｐｌ５0０ｆｃＩｒｔ（ｘ２）逡逑（Ｐ２５／Ｐ２７逡逑ｒ邋ＦＶ邋ｌ邐逡逑ｉｐＰ邋．．逡逑／邐Ｖ邐＼逡逑ＣａｐＺ邋ａ／ｐ邐Ａｒｐｌ邋（ｘ８）邐＇逡逑Ａｒｐｌｌ逡逑圖１．１０＞０１３０＾１１復合體的結(jié)構(gòu)不意圖（引自＾召１１0１６１３１．，２０１０）逡逑Ｆｉｇ邋１．１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｏｖｅｒａｌｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｄｙｎａｃｔｉｎ邋ｃｏｍｐｌｅｘ邋（ｆｒｏｍ邋Ｊａｃｑｕｏｔ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１０邋）逡逑Ｄｙｎａｃｔｉｎ復合體有４個Ｄｍｎ亞基，Ｄｍｎ亞基的Ｎ－末端１－９１氨基酸區(qū)域是高度保守的，該逡逑區(qū)域調(diào)節(jié)Ｄｍｎ與Ａｉｐｌ的連接，這種連接作用是獨立于ｄｙｎａｃｔｉｎ的另外兩個亞基ｐｌ５０Ｇｌｕｅｄ和Ｐ２４逡逑的（Ｍｅｌｋｏｎｉａｎｅｔａｌ．，２００７）。在哺乳動物中，Ｄｍｎ蛋白的Ｎ－末端１－９１氨基酸過表達會抑制ｄｙｎｅｉｎ逡逑依賴和非依賴性的ｄｙｎａｃｔｉｎ復合體的功能（Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ邋ｅｔａｌ．，１９９７）。Ｊａｃｑｕｏｔ等通過ＲＮＡ千擾貧逡逑驗證實

博士學位論文逡逑ＤＯＣＴＯＲＡＬ邋ＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ逡逑信號，開始自我更新的過程，然后經(jīng)歷共分化（圖１．２）。ＧＳＣｓ經(jīng)過４次連續(xù)分裂形成１６個精逡逑原細胞，精原細胞經(jīng)過生長轉(zhuǎn)變成精母細胞；ＣｙＳＣｓ分化成包囊細胞。精母細胞經(jīng)歷減數(shù)分裂，逡逑由包囊細胞包裹著，，形成一個６４個圓形精子的合胞體（ＺｏｌｌｅｒａｎｄＳｃｈｕｌｚ，２０１２；Ｍｉｙａｕｃｈｉｅｔａｌ．，逡逑２０１３）。逡逑ｅａｒｌｙ邋ｓｔａｇｅ邋ＣＣ？邐＾邋ｌａｔｅ邋ｓｔａｇｅ邋ＣＣｓ逡逑圖１．２果蠅精子發(fā)生過程中生殖細胞與包囊細胞發(fā)育示意圖逡逑ＣｙＳＣ：包囊干細胞；ＧＳＣ：生殖干細胞；ＧＢ：生殖母細胞；ＳＧ：精原細胞；ＳＣ：精母細胞；逡逑ＣＣ：包囊細胞；ＨＣＣ：頭部包囊那個細胞；ＴＣＣ：尾部包囊細胞（引自Ｒｉｃｈａｒｄ邋ａｎｄ邋Ｃｏｒｄｕｌａ，邋２０１２）逡逑Ｆｉｇ邋１．２邋Ｇｒａｐｈｉｃ邋ｄｅｐｉｃｔｉｎｇ邋ｔｈｅ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｇｅｒｍｌｉｎｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｎｄ邋ｃｙｓｔ邋ｃｅｌｌｓ邋ｄｕｒｉｎｇ邋Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ逡逑ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ逡逑ＣｙＳＣ，邋ｃｙｓｔ邋ｓｔｅｍ邋ｃｅｌｌ；邋ＧＳＣ，邋ｇｅｒｍｌｉｎｅ邋ｓｔｅｍ邋ｃｅｌｌ；邋ＧＢ，邋ｇｏｎｉａｌｂｌａｓｔ；邋ＳＧ，邋ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａ；邋ＳＣ，逡逑ｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅｓ；邋ＣＣ，邋ｃｙｓｔ邋ｃｅｌｌｓ；邋ＨＣＣ，邋ｈｅａｄ邋ｃｙｓｔ邋ｃｅｌｌｓ；邋ＴＣＣ，邋ｔａｉｌ邋ｃｙｓｔ邋ｃｅｌｌｓ邋（ｆｒｏｍ邋Ｒｉｃｈａｒｄ邋ａｎｄ邋Ｃｏｒｄｕｌａ，逡逑２０１２邋）逡逑１．２．２圓形精子延長逡逑圓形精子形成后
【學位授予單位】：華中師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q963

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙曉俊;李雅娟;顧蔚;;果蠅精子發(fā)生相關(guān)基因及其功能調(diào)控[J];生理科學進展;2013年02期

2 孫曉平;果蠅精子發(fā)生研究進展[J];細胞生物學雜志;1992年01期

3 李士彥;;與果蠅有關(guān)的試題歸類分析[J];中學生物教學;2006年12期

4 周洲;;全球:著手研究斑翅果蠅[J];中國果業(yè)信息;2015年11期

5 陳漢章;如何鑒別雄性果蠅和雌性果蠅[J];生物學教學;2005年03期

6 禾本;;美國:斑翅果蠅愛甜軟水果[J];中國果業(yè)信息;2013年07期

7 張衛(wèi)中;繁育不育雄蠅消滅果蠅[J];柑桔與亞熱帶果樹信息;2001年12期

8 林芳花;鄭愛娥;李燕秋;朱華;;海螵蛸與龜甲膠對果蠅繁殖力影響的對比研究[J];時珍國醫(yī)國藥;2016年12期

9 ;一組關(guān)于果蠅研究的重要文章[J];昆蟲知識;2008年01期

10 ;多與年輕人相處有助長壽[J];科學大觀園;2009年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 郭愛克;;果蠅的學習、記憶與決策[A];2000上�？萍颊搲疊IO-X研討會暨中德醫(yī)學生物物理和上海流變學研討會論文集[C];2000年

2 張柯;郭建增;郭愛克;;多巴胺系統(tǒng)和蘑菇體共同介導果蠅的抉擇過程[A];第十次中國生物物理學術(shù)大會論文摘要集[C];2006年

3 邵素娟;;國際上的果蠅資源中心和基因工程[A];第十一屆中國生命科學公共平臺管理與發(fā)展研討會摘要集[C];2018年

4 龔海韻;劉力;;果蠅學習記憶中的信息整合[A];第九次全國生物物理大會學術(shù)會議論文摘要集[C];2002年

5 桂耀庭;唐愛發(fā);余振東;張立兵;張鍵榮;李賢新;蔡志明;;精子發(fā)生相關(guān)基因的篩選和功能研究[A];中國生理學會2007年消化內(nèi)分泌生殖學術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2007年

6 王順鵬;唐世明;李巖;郭愛克;;果蠅在抉擇過程中的行為修飾[A];第九次全國生物物理大會學術(shù)會議論文摘要集[C];2002年

7 陳吉龍;劉潔;陳智偉;張玉廉;;果蠅yellow基因在發(fā)育中組織特異性表達的調(diào)節(jié)[A];中國動物科學研究——中國動物學會第十四屆會員代表大會及中國動物學會65周年年會論文集[C];1999年

8 劉剛;溫艾;龔海韻;劉力;;果蠅蘑菇體的類認知功能[A];第一屆全國腦與認知科學學術(shù)研討會論文集[C];2005年

9 桂耀庭;唐愛發(fā);余振東;郭新;龍云;李賢新;周錦堂;朱輝;葉炯賢;蔡志明;;精子發(fā)生相關(guān)基因的篩選與鑒定[A];中華醫(yī)學會第八次全國男科學學術(shù)會議論文集[C];2007年

10 桂耀庭;唐愛發(fā);余振東;張立兵;張鍵榮;李賢新;蔡志明;;精子發(fā)生相關(guān)基因的篩選和功能研究[A];第一屆中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學分會、中國動物學會生殖生物學分會聯(lián)合年會論文匯編[C];2007年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 唐一塵;科學家尋找野生非洲果蠅進化線索[N];中國科學報;2018年

2 北京大學生命科學學院教授 饒毅;果蠅研究為何長盛不衰[N];人民日報;2013年

3 洪文;非洲用紡織蟻控制果蠅危害[N];中國綠色時報;2007年

4 記者 毛黎邋馮衛(wèi)東;科學家完成12種果蠅基因比較研究[N];科技日報;2007年

5 ;改變一個簡單基因果蠅變成“同性戀”[N];新華每日電訊;2005年

6 曹麗君;美發(fā)現(xiàn)控制果蠅睡眠長短的基因[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2005年

7 ;果蠅失戀也會“借酒澆愁”[N];新華每日電訊;2012年

8 ;果蠅打架,原是“無結(jié)果”基因作祟[N];新華每日電訊;2006年

9 本報記者 呂媛;我科學家發(fā)現(xiàn)果蠅其實很聰明[N];北京科技報;2004年

10 記者 李斌 張學全;果蠅也能辨形觀色[N];新華每日電訊;2001年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 吳春紅;Dynamitin調(diào)控雄性果蠅生殖和幼蟲發(fā)育的機制研究[D];華中師范大學;2017年

2 徐隆昌;RNF138在精子發(fā)生中的功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2016年

3 吳帥帥;馬驢高效擴繁技術(shù)研究及應(yīng)用[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2019年

4 徐康;多倍體鯽鯉雄性育性機制研究[D];湖南師范大學;2015年

5 唐亮;CD82在非梗阻性無精癥精子發(fā)生障礙中的機制研究[D];安徽醫(yī)科大學;2018年

6 傅洋;乙型肝炎病毒HBx蛋白對人精子功能及胚胎發(fā)育影響的研究[D];廣州醫(yī)科大學;2018年

7 張清華;Ppplr36參與精子發(fā)生與自噬的研究[D];武漢大學;2016年

8 ASIF MEHFOOZ;蘆丁和甲狀腺素對束縛應(yīng)激狀態(tài)下成年小鼠睪丸精子發(fā)生的潛在保護作用研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2017年

9 劉騰飛;中華鱉（Pelodiscus sinensis）精子發(fā)生和精子儲存的調(diào)控機制[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2017年

10 付駿;OY-TES-1的表達及其抗體對精子功能影響的研究[D];廣西醫(yī)科大學;2018年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 王翠平;Wolbachia感染對雄果蠅繁殖力的影響機理研究[D];華中師范大學;2012年

2 車娜克;攝食限制對雄果蠅（Drosophila melanogaster）壽命和生殖能力的影響[D];陜西師范大學;2007年

3 侯明月;ocnus敲降對果蠅育性的影響[D];華中師范大學;2015年

4 張寧仙;基于模式識別方法的果蠅振翅聲分類研究[D];陜西師范大學;2011年

5 劉淑琰;鲇精巢發(fā)生、發(fā)育規(guī)律及其精子特性研究[D];河南師范大學;2017年

6 吳易軒;果蠅優(yōu)化算法改進及應(yīng)用研究[D];廣西民族大學;2017年

7 陸民迪;果蠅優(yōu)化算法改進與分析研究[D];廣西大學;2015年

8 謝德娟;限食與高營養(yǎng)對雄果蠅衰老與生殖的作用和機制研究[D];陜西師范大學;2008年

9 申鑫;SPATA1與纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白IFT20的相互作用及其在精子發(fā)生中的表達和定位[D];武漢科技大學;2019年

10 來兄;TSSK6與IZUMO1和IZUMO4在綿羊精子上的共定位[D];內(nèi)蒙古大學;2019年

本文編號：2586092