【摘要】：煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)是動(dòng)物體內(nèi)重要的配體門控離子通道,介導(dǎo)以乙酰膽堿為神經(jīng)遞質(zhì)的快速興奮神經(jīng)傳導(dǎo)。在人類和其他哺乳動(dòng)物中,nAChRs與多種疾病相關(guān),例如阿爾茲海默癥、帕金森綜合癥、精神分裂癥等。在昆蟲中,nAChRs是新煙堿類、多殺菌素類等殺蟲劑的作用靶標(biāo)。在動(dòng)物體內(nèi),nAChRs的功能依賴于其與許多蛋白質(zhì)的相互作用,這些蛋白參與調(diào)控受體轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊、組裝、成熟、運(yùn)輸、定位等一系列合成關(guān)鍵過程或者直接調(diào)節(jié)其功能特性,如蛋白激酶A對(duì)昆蟲神經(jīng)元上nAChRs的調(diào)節(jié)作用影響細(xì)胞對(duì)殺蟲劑的敏感性。因此,這些互作蛋白的研究對(duì)疾病治療、殺蟲劑抗性治理和新型殺蟲劑開發(fā)都有深遠(yuǎn)意義。雖然nAChRs互作蛋白研究在脊椎動(dòng)物中已經(jīng)比較成熟和系統(tǒng),但在昆蟲中的研究相對(duì)較少,目前僅發(fā)現(xiàn)RIC-3 (resistant to inhibitors of cholinesterase-3)、Lynx、鈉鉀泵和一些蛋白激酶參與調(diào)節(jié)昆蟲nAChRs功能。本文以東亞飛蝗為實(shí)驗(yàn)材料,通過神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,得到大量離子通道及nAChRs相關(guān)蛋白的序列信息。利用非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),研究了東亞飛蝗Lynx蛋白對(duì)nAChRs功能調(diào)節(jié)作用的選擇性。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,選取分別參與nAChRs合成途徑中組裝、運(yùn)輸和聚集三個(gè)關(guān)鍵步驟的調(diào)控蛋白,ubiquilin-1、PICK1和CRELD2,利用背部不對(duì)稱中央神經(jīng)元(dorsal unpaired median neuron, DUM神經(jīng)元)RNAi,結(jié)合熒光染料細(xì)胞膜電位檢測(cè)方法及全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),證實(shí)這3個(gè)蛋白參與昆蟲nAChRs功能調(diào)控,ubiquilin-1和PICK1對(duì)受體表現(xiàn)出負(fù)調(diào)控作用,而CRELD2是受體的正向調(diào)控蛋白。一、東亞飛蝗神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組昆蟲神經(jīng)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的基本單位,細(xì)胞膜上分布著大量離子通道,細(xì)胞電生理活動(dòng)以離子通道的開放和閉合為基礎(chǔ),通過控制鈉、鉀、鈣、氯等離子的胞內(nèi)外離子流來完成神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo),其中nAChRs不僅是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞上重要的配體門控離子通道,也是多類殺蟲劑的作用靶標(biāo),因此神經(jīng)細(xì)胞是研究nAChRs的優(yōu)良材料,目前已得到廣泛應(yīng)用。本文通過比較東亞飛蝗和美洲大蠊腹神經(jīng)索的外部特征以及二者通過常規(guī)酶解法獲得的DUM神經(jīng)元數(shù)量和細(xì)胞懸浮液狀態(tài),發(fā)現(xiàn)東亞飛蝗腹神經(jīng)索脂肪少,易清理;經(jīng)過酶解后的DUM神經(jīng)元數(shù)量多,每條東亞飛蝗腹神經(jīng)索可解離出28±5個(gè)DUM神經(jīng)元,美洲大蠊僅解離出8±1個(gè)DUM神經(jīng)元,且所得東亞飛蝗DUM神經(jīng)元中細(xì)胞直徑適合電生理實(shí)驗(yàn)的比例高;另外,東亞飛蝗DUM神經(jīng)元細(xì)胞懸浮液雜質(zhì)更少,對(duì)后續(xù)神經(jīng)元的離體培養(yǎng)有利,因此選用東亞飛蝗神經(jīng)系統(tǒng)作為本實(shí)驗(yàn)的研究材料。目前,東亞飛蝗已完成基因組測(cè)序,但基因信息尚未完全公布,神經(jīng)功能相關(guān)的基因信息較少,在本研究之前只能搜索到4個(gè)nAChR亞基的全長(zhǎng),因此本章用酶解法和機(jī)械解離法對(duì)東亞飛蝗中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行分離,然后利用細(xì)胞密度梯度離心技術(shù)分離純化神經(jīng)細(xì)胞,得到分離純化東亞飛蝗神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞密度梯度分離體系,使離心后神經(jīng)細(xì)胞比例達(dá)到80%左右。對(duì)純化后的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,得到大量神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)基因的信息,包括序列不同的11個(gè)nAChR亞基,3個(gè)γ-氨基丁酸門控離子通道亞基和7個(gè)谷氨酸門控氯離子通道基因片段,另外搜索到3個(gè)蛋白序列不同的Lynx,分別命名為L(zhǎng)oc-lynx1 (KP694213)、Loc-lynx2 (KP694214)和Loc-lynx3(KP694215),及可能與nAChRs結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)的蛋白,如14-3-3蛋白、RIC-3、ubiquilin-1、CRELD2、PICK1 等。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR構(gòu)建Lynx、ubiquilin-1、PICK1和CRELD2對(duì)應(yīng)基因的組織表達(dá)譜發(fā)現(xiàn),lynx基因特異性地在神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá),說明其對(duì)nAChRs的調(diào)節(jié)可能是特異的;另外3個(gè)基因組織分布廣泛,說明它們可能參與更多生物過程。二、東亞飛蝗Lynx蛋白對(duì)煙堿型乙酰膽堿受體調(diào)節(jié)作用的選擇性在過去幾十年的研究中發(fā)現(xiàn),許多蛋白在nAChRs的合成和功能中扮演著重要角色,根據(jù)受體與相關(guān)蛋白之間的互作模式,這些互作蛋白可以分為分子伴侶、調(diào)控蛋白和調(diào)節(jié)蛋白。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)褐飛虱神經(jīng)系統(tǒng)中Lynx的作用機(jī)制進(jìn)行了初步分析,發(fā)現(xiàn)該類蛋白對(duì)nAChRs亞型具有選擇性。本文在東亞飛蝗神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中,鑒定出3個(gè)不同的Lynx蛋白,并對(duì)該類蛋白調(diào)節(jié)nAChRs功能進(jìn)行了系統(tǒng)研究,包括對(duì)不同的激動(dòng)劑、結(jié)合位點(diǎn)和調(diào)節(jié)模式的選擇性。在非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中,Lynx蛋白顯著增大激動(dòng)劑誘導(dǎo)的重組nAChRs Locα1/rβ2和Locα2/rβ2的最大電流值,但不改變受體對(duì)激動(dòng)劑的敏感性。Loc-lynx 1和Loc-lynx3僅調(diào)節(jié)Locα1/rβ2的電流響應(yīng),而Loc-lynx2特異性地調(diào)節(jié)Locα2/rβ2,因此說明Lynx的調(diào)節(jié)對(duì)nAChRs亞型具有選擇性。當(dāng)以吡蟲啉和epibatidine為激動(dòng)劑時(shí),Loc-lynx1分別使Locα1/rβ2電流上升4.31倍和4.18倍,Loc-lynx3使電流上升6.47倍和5.82倍;當(dāng)以乙酰膽堿為激動(dòng)劑,Loc-lynx1和Loc-lynx3分別使電流增強(qiáng)3.18倍和2.93倍,因此Loc-lynx1和Loc-lynx3對(duì)吡蟲啉和epibatidine誘導(dǎo)的內(nèi)向電流的調(diào)節(jié)作用強(qiáng)于乙酰膽堿的,說明Lynx對(duì)不同激動(dòng)劑誘導(dǎo)的電流的調(diào)節(jié)能力不同。放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,3個(gè)Lynx蛋白中,僅Loc-lynx1顯著增加了Locα1/rβ2對(duì)[3H]epibatidine 的最大結(jié)合量,因此 Loc-lynx1 對(duì) nAChRs 具有與 Loc-lynx2 和Loc-lynx3不同的調(diào)節(jié)模式。綜上所述,這3個(gè)Lynx蛋白是nAChRs的調(diào)節(jié)蛋白,并且對(duì)nAChRs的調(diào)節(jié)作用具有選擇性,具體表現(xiàn)在三方面:對(duì)nAChRs亞型的選擇性、對(duì)不同激動(dòng)劑的選擇性和不同的Lynx具有不同的調(diào)節(jié)模式。三、東亞飛蝗煙堿型乙酰膽堿受體調(diào)控蛋白鑒定與功能研究已有研究發(fā)現(xiàn),蛋白激酶可以改變nAChRs對(duì)殺蟲劑的敏感性,說明nAChRs、nAChRs互作蛋白及殺蟲劑敏感性之間相互關(guān)聯(lián),本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱nAChR α8亞基表達(dá)水平下調(diào)導(dǎo)致對(duì)吡蟲啉的抗性,因此鑒定新的昆蟲nAChRs調(diào)控蛋白對(duì)殺蟲劑抗性機(jī)理研究、抗性治理和新型殺蟲劑開發(fā)十分必要。本文利用細(xì)胞RNAi技術(shù),干擾編碼ubiquilin-1、CRELD2和PICK1蛋白的基因在東亞飛蝗DUM神經(jīng)元中的表達(dá),然后利用電壓敏感性陰離子染料DiBAC4(3)檢測(cè)激動(dòng)劑引起的細(xì)胞膜電位變化和全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄激動(dòng)劑誘導(dǎo)的電流反應(yīng),研究ubiquilin-1、CRELD2和PICK1對(duì)nAChRs的調(diào)控作用。研究結(jié)果表明,當(dāng)DUM神經(jīng)元轉(zhuǎn)染靶標(biāo)基因siRNA48h時(shí),ubiquilin-1、CRELD2和PICK1 mRNA的干擾效率分別為79.4%、73.4%和85.6%,達(dá)到比較理想的干擾效果。相同劑量吡蟲啉處理下,ubiquilin-1或PICK1被干擾的DUM神經(jīng)元熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組,分別為對(duì)照組的1.47倍和1.48倍,說明干擾后細(xì)胞膜電位變化大于對(duì)照組;與之相反,當(dāng)CRELD2被干擾后,DUM神經(jīng)元熒光強(qiáng)度顯著小于對(duì)照組,僅為對(duì)照組的72.53%,說明其膜電位變化小于對(duì)照組。膜片鉗記錄電流結(jié)果與熒光觀察結(jié)果一致,乙酰膽堿和吡蟲啉誘導(dǎo)ubiquilin-1或PICK1干擾組DUM神經(jīng)元產(chǎn)生的內(nèi)向電流顯著大于對(duì)照組,而CRELD2干擾組神經(jīng)元的電流顯著小于對(duì)照組,因此這3個(gè)蛋白的表達(dá)量下降影響神經(jīng)元細(xì)胞膜上nAChRs對(duì)激動(dòng)劑的響應(yīng)。結(jié)合膜電位和電流變化結(jié)果推測(cè),這3個(gè)蛋白是東亞飛蝗nAChRs的調(diào)控蛋白,并且ubiquilin-1和PICK1表現(xiàn)出負(fù)調(diào)控作用,而CRELD2對(duì)受體具有正向調(diào)控作用。另外發(fā)現(xiàn),低劑量(0.1mM)激動(dòng)劑的電流對(duì)α-銀環(huán)蛇毒素(α-bungarotoxin, α-Bgt)完全不敏感,而較高劑量(10mM)誘導(dǎo)的部分電流對(duì)α-Bgt敏感,另一部分不敏感,因此東亞飛蝗DUM神經(jīng)元中存在兩種藥理學(xué)特性不同的nAChRs,即α-Bgt敏感型和α-Bgt不敏感型nAChRs。并且0.1 mM激動(dòng)劑處理下這3個(gè)蛋白被干擾均導(dǎo)致內(nèi)向電流發(fā)生顯著變化,但10 mM激動(dòng)劑處理下僅ubiquilin-1干擾組DUM神經(jīng)元產(chǎn)生的α-Bgt敏感電流顯著大于對(duì)照組,而PICK 1和CRELD2干擾組與對(duì)照沒有顯著差異,說明ubiquilin-1同時(shí)調(diào)控α-Bgt敏感型和α-Bgt不敏感型nAChRs,而PICK1和CRELD2僅調(diào)控α-Bgt不敏感型nAChRs.
【圖文】：

神經(jīng)元（ｐｒｏｘｉｍａｌｂｒａｎｃｈｉｎｇ邋１邋ｎｅｕｒｏｎ）、近端分支邋３邋神經(jīng)元（ｐｒｏｘｉｍａｌｂｒａｎｃｈｉｎｇ邋３邋ｎｅｕｒｏｎ）、逡逑對(duì)稱神經(jīng)元（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ邋ｎｅｕｒｏｎ）、致密模糊神經(jīng)元（ｆｏｚｚｙ邋ｃｏｍｐａｃｔ邋ｎｅｕｒｏｎ，ＦＣ－ｎｅｕｒｏｎ）逡逑和曲折花邊神經(jīng)元（ｒｉｃｋ邋ｒａｃｋ邋ｎｅｕｒｏｎ，ＲＲ－ｎｅｕｒｏｎ）（圖１－１）。前三種神經(jīng)元是體內(nèi)的逡逑投射神經(jīng)元，剩余三種神經(jīng)元屬于無長(zhǎng)突局部中間神經(jīng)元［１１］。２００３年，Ｐａｒｋ等人發(fā)現(xiàn)逡逑家蠶（５0７＾＿ｙｘｍｏｒ／）的觸角葉神經(jīng)細(xì)胞從蛹期第二天可以觀察到四種形態(tài)學(xué)不同的神逡逑經(jīng)細(xì)胞，分別是單極、雙極、多極和投射神經(jīng)元（圖１－２），它們?cè)谠囵B(yǎng)中長(zhǎng)成形逡逑態(tài)成熟的神經(jīng)元細(xì)胞大約需要兩周時(shí)間［１２］。單極神經(jīng)元是最常見的類型，具有易觀察、逡逑完全生長(zhǎng)的特點(diǎn)（圖１－２Ａ）。雙極神經(jīng)元在培養(yǎng)過程中可以生長(zhǎng)成其他類型，比如投逡逑射神經(jīng)元（圖１－２Ｂ）。多極神經(jīng)元從胞體伸展出來需要一些過程，且不總是表現(xiàn)出投逡逑射神經(jīng)元軸突長(zhǎng)的形態(tài)特征（圖１－２Ｃ和Ｄ）。與其他神經(jīng)元相比，，投射神經(jīng)元具有一逡逑個(gè)類似軸突的結(jié)構(gòu)以及豐富的分叉的終樹突（圖１－２Ｅ１和Ｅ２）。逡逑２逡逑

重要實(shí)驗(yàn)材料和熱點(diǎn)［４７’４８’邋６Ｑ＇６４］。逡逑急性分離的美洲大蠊ＤＵＭ神經(jīng)元的典型形態(tài)是梨形，具有球形胞體和軸突，細(xì)胞逡逑膜完整光滑，形態(tài)飽滿（圖１－３）。根據(jù)胞體大小和軸突長(zhǎng)度的不同（軸突長(zhǎng)度／胞體直逡逑徑）大致可分為三類：第一種比值〈１的神經(jīng)元（圖１－３Ａ），數(shù)量最多，占大約６０％，其逡逑中直徑５０－６０｜ａｍ的神經(jīng)元是電生理實(shí)驗(yàn)研宄的最佳材料；第二種１Ｓ比值＜２大小的神經(jīng)逡逑元比例約為２０％邋（圖１－３Ｂ）；第三種，比值之２的神經(jīng)元約占１０％邋（圖１－３Ｃ），這類細(xì)胞逡逑直徑多小于４０邋ｐｍ，軸突較長(zhǎng)，電壓不易鉗制，因此不應(yīng)用于電生理實(shí)驗(yàn)［６５］。急性分逡逑離的ＤＵＭ神經(jīng)元只具有一個(gè)初級(jí)的軸突，經(jīng)過體外培養(yǎng)后的神經(jīng)元大多具有多極軸逡逑突，且最終的軸突數(shù)量與初級(jí)的軸突長(zhǎng)度呈相關(guān)性，隨著初級(jí)軸突長(zhǎng)度的增加，神經(jīng)逡逑元培養(yǎng)過程中生長(zhǎng)出的極數(shù)減少（圖１－４）邋ＰＩ。逡逑Ａ邐Ｂ邐Ｃ逡逑＾邋＊邋▲、邋＇邋＼邋＇逡逑ｏ邋0■邋．逡逑，邐■？邐ｅ逡逑？邋？邋＇邋￣邋．邋—邋．邋—逡逑圖１－３美洲大蠊急性分離ＤＵＭ神經(jīng)元Ａ：軸突長(zhǎng)度／胞體直徑小于１的ＤＵＭ神經(jīng)元。Ｂ：軸突逡逑長(zhǎng)度／胞體直徑大于等于１小于２的ＤＵＭ神經(jīng)
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q966


本文編號(hào)：2568590