【摘要】：特異腐質(zhì)霉具有強(qiáng)大的纖維素降解和纖維素酶分泌能力,因此在生物質(zhì)能源、釀造工業(yè)、紡織工業(yè)及高效外源基因表達(dá)等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。但目前對(duì)該菌的研究多停留于胞外酶的純化和相關(guān)酶基因的克隆表達(dá),關(guān)于其成熟表達(dá)系統(tǒng)的研究卻鮮有報(bào)道。本研究以特異腐質(zhì)霉Y1為出發(fā)菌株,利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法,成功構(gòu)建了該菌的高效遺傳操作體系。利用內(nèi)源3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子元件實(shí)現(xiàn)了外源基因,包括G418和潮霉素B的抗性基因,以及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白編碼基因在特異腐質(zhì)霉中的功能性表達(dá)。利用纖維二糖水解酶NCE2啟動(dòng)子元件,成功實(shí)現(xiàn)了特異腐質(zhì)霉HiBgl3A和Talaromyces leycettanus JCM12802 TeBgl3A在特異腐質(zhì)霉中的分泌性表達(dá)。同時(shí),我們對(duì)轉(zhuǎn)化參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,最終實(shí)現(xiàn)了超過(guò)300個(gè)轉(zhuǎn)化子/106分生孢子的轉(zhuǎn)化效率。在此基礎(chǔ)上,利用T-DNA隨機(jī)插入突變的方法建立了特異腐質(zhì)霉的突變體庫(kù),并從中篩選得到了纖維素酶高產(chǎn)突變株T4。突變株T4的濾紙酶活、內(nèi)切β-1,4葡聚糖酶酶活、纖維二糖水解酶活力、β-葡萄糖苷酶酶活力以及木聚糖酶活較野生型菌株均有了大幅度提升,分別提高了60%,440%,320%,41%和81%。繼而通過(guò)克隆鑒定該突變株中T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列,獲得了兩個(gè)與纖維素酶表達(dá)分泌可能相關(guān)的基因tdiD和proA。本研究為我們改良特異腐質(zhì)霉菌株,優(yōu)化纖維素降解酶系,使其成為高溫中性纖維素酶的工業(yè)生產(chǎn)菌株奠定了良好基礎(chǔ),還可為實(shí)現(xiàn)異源基因在特異腐質(zhì)霉的高效表達(dá)提供必要的技術(shù)保障。此外,我們還克隆鑒定了特異腐質(zhì)霉中新型內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶編碼基因Hicel6C和β-1,3(4)-葡聚糖酶編碼基因Hicel16A,成功實(shí)現(xiàn)了其在畢赤酵母中的異源表達(dá),并對(duì)重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究分析。與大多數(shù)真菌來(lái)源的酸性內(nèi)切葡聚糖酶不同,重組HiCel6C最適作用pH為6.5,具有較好的耐堿性,在pH8.0時(shí)仍具有98%的相對(duì)酶活力,在pH 9.0和10.0時(shí),仍有61.2%和27.6%的相對(duì)活力。在pH 5.0-11.0的范圍內(nèi),都具有良好的pH穩(wěn)定性,37℃處理1 h后,仍保留80%以上的酶活力。HiCel6C最適反應(yīng)溫度為70℃,具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性,60℃處理1h后,仍保留90%以上的酶活力。在70℃,pH 6.5條件下,以大麥葡聚糖為底物時(shí),HiCel6C的Km值和Vmax分別為1.29 mg/mL和752μmol/min·mg。HiCel6C可以降解大麥葡聚糖、地衣多糖和羧甲基纖維素鈉,卻對(duì)昆布多糖無(wú)降解活性,表明其特異性的切割β-1,4-糖苷鍵。HiCel6C隨機(jī)切割纖維寡糖內(nèi)部的糖苷鍵,是一個(gè)典型的內(nèi)切酶。HiCel6C的這些優(yōu)良性質(zhì)使其在許多應(yīng)用領(lǐng)域,如生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化、紡織、啤酒釀造和造紙工業(yè)等領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。Hicell6A成熟cDNA全長(zhǎng)861 bp,編碼了286個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子。HiCel16A包含一個(gè)N端20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列和一個(gè)保守的GH16家族的催化結(jié)構(gòu)域。我們成功實(shí)現(xiàn)了HiCel16A在畢赤酵母GS115中的異源表達(dá)。重組HiCel16A可以降解大麥葡聚糖、地衣多糖和昆布多糖,卻對(duì)羧甲基纖維素鈉無(wú)降解活性,表明其HiCel16A是一個(gè)β-1,3(4)-葡聚糖酶。這是特異腐質(zhì)霉中第一個(gè)得到功能鑒定的β-1,3(4)-葡聚糖酶。重組HiCel16A最適作用pH為5.5,最適反應(yīng)溫度為55℃。與大多數(shù)特異腐質(zhì)霉來(lái)源的纖維素酶和半纖維素酶類似,重組HiCel16A在中性偏堿(pH 5-9)范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性,37℃處理1 h后,仍保留90%以上的酶活力。在55℃,pH 5.5反應(yīng)條件下,以大麥葡聚糖為底物時(shí),HiCel16A的Km值和Vmax分別為0.91 mg·ml-1和1530 μmol·min-1·mg-1。 HiCel16A的優(yōu)良酶學(xué)性質(zhì)使其可以廣泛應(yīng)用于多種領(lǐng)域,如近年來(lái)報(bào)道的應(yīng)用降解混合糖苷鍵的β-葡聚糖酶水解大麥和地衣生產(chǎn)生物燃料,應(yīng)用β-1,3-葡聚糖酶防治植物的真菌病害等。
【圖文】：

Ｗｅｓｔ知ｅｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１0。被氧化物的出現(xiàn)明這是一種新型纖維素降解制。逡逑此外，還有一些真菌酶系組分也參與到纖維素的降解中。例如，刪除粗糖逡逑脈抱菌中纖維二糖脫氨酶（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ－ｄ濁ｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，邋ＣＤＨ）編碼基因Ｃ誠(chéng)ｉ－ｉ時(shí)，逡逑纖維素酶活力大幅下降。ＣＤＨ促進(jìn)作用的發(fā)揮與ＧＨ６１蛋白的存在有關(guān)，這是逡逑一種與褐腐真菌中氧化還原酶通過(guò)產(chǎn)生徑自由基攻擊纖維素所不同的、直接由逡逑氧化酶作用于底物的纖維素氧化降解機(jī)制（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１１）。向里氏木霉酶系逡逑中加入重組的ＣＤＨ時(shí)，葡萄糖磨酸的釋放和半纖維素的降解得到促進(jìn)（Ｂｅｙ邋ｅｔａｌ．，逡逑２０１１）。被命名為ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ的蛋白與纖維素酶也具有協(xié)同水解作用（Ｗａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２０１１）。Ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ具有典型的纖維素酶結(jié)構(gòu)域組成模式及轉(zhuǎn)錄調(diào)控特化可使微逡逑晶纖維素粒徑變小，，但檢測(cè)不到還原糖的產(chǎn)生（Ｇｏｕｒｌａｙ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１３；邋Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ邋ｅｔ逡逑ａｌ．，２００２）。纖維素醇中的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域在單獨(dú)存在時(shí)，也可Ｗ通過(guò)改變結(jié)晶逡逑巧維素結(jié)構(gòu)來(lái)促進(jìn)后續(xù)的纖維素酶水解（Ｈａｌｌ邋ｅｔ邋ａｌ．，２0ｎ）。逡逑ｂｅｔａ邋續(xù)邐戶‘顆—？逡逑

我們檢測(cè)了潮霉素Ｂ和Ｇ４１８對(duì)特異腐質(zhì)霉在ＰＤＡ培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情逡逑況的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ｄＯ帖／ｍＬ的潮霉素Ｂ和＾０帖／ｍＬ的Ｇ４１８可Ｗ逡逑完全抑制將異腐質(zhì)霉的生長(zhǎng)（圖２－１邋）。因此，潮霉素Ｂ抗性基因（邸Ａ）和Ｇ４１８逡逑抗性基因均可作為特異腐質(zhì)霉外源基因轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記。逡逑Ｇｒｏｗｔｈ邐＋？？邐？？邐？邐－邐－逡逑０邐，邋．１化ｕｇ＇ｍｌ邐說(shuō)倆？晵巧啼Ｉ。三戶奶巧竹ｆ。山－逡逑ＰＤＡ＋Ｇ邋州邋ｅｔｉｃｉｎ邐ｉ逡逑說(shuō)州邋＇．’，Ｓ邐－邐５的／ｍｌ邐１巧Ｓ巧＇Ｔｉｌ邐

本文編號(hào)：2565941