本文關(guān)鍵詞：十足目甲殼動物頂體構(gòu)架體及精子發(fā)生相關(guān)蛋白功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：甲殼經(jīng)濟(jì)動物的繁殖是我國水產(chǎn)界研究的熱門話題。而精子發(fā)生機(jī)制是繁殖生物學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的重大科學(xué)問題之一。精子發(fā)生機(jī)制的研究是人工進(jìn)行水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)物種繁殖的基礎(chǔ)。精子發(fā)生過程中的細(xì)胞骨架的重構(gòu)、分子調(diào)控機(jī)制是目前該領(lǐng)域的研究熱點。與哺乳動物精子發(fā)生存在巨大差異的地方是,甲殼動物精子沒有鞭毛結(jié)構(gòu)。其精子發(fā)生過程主要包含頂體形成和細(xì)胞核形變事件。我們對甲殼綱十足目動物精子發(fā)生過程中細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、動力學(xué)機(jī)制以及生理學(xué)方面進(jìn)行了研究。第一部分十足目游泳亞目真蝦屬秀麗白蝦精子發(fā)生細(xì)胞骨架及其動力學(xué)機(jī)制研究頂體架構(gòu)體(AFS)是真蝦類精子形成中出現(xiàn)的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),首次發(fā)現(xiàn)是在日本沼蝦精子發(fā)生過程中,但其組成以及功能目前尚未有報道。我們以太湖主要的經(jīng)濟(jì)蝦類秀麗白蝦作為研究模型,研究AFS是否是真蝦類精子形成中普遍存在的骨架結(jié)構(gòu)。通過免疫熒光實驗對Tubulin在精子形成不同時期的定位實驗,證明秀麗白蝦精細(xì)胞中也存在AFS結(jié)構(gòu),其主要組分為微管,根據(jù)其形態(tài)預(yù)測還有少量微絲以維持細(xì)胞柔韌性。這一結(jié)果說明AFS是真蝦類精子發(fā)生共同存在的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。為研究與該細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)共同發(fā)揮功能的馬達(dá)蛋白,我們克隆了驅(qū)動蛋白kifc1基因,并對其結(jié)構(gòu)、基因及蛋白的分布、運載的貨物進(jìn)行了研究。通過免疫熒光實驗對細(xì)胞器高爾基體標(biāo)記物GM130以及線粒體標(biāo)記物與KIFC1的共定位,我們發(fā)現(xiàn)驅(qū)動蛋白KIFC1與上述細(xì)胞物質(zhì)在頂體形成部位以及細(xì)胞核一側(cè)邊緣具有高度共定位,暗示這些細(xì)胞成分是KIFC1運輸?shù)呢浳铩＞C上所述,驅(qū)動蛋白KIFC1依賴AFS細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)運輸細(xì)胞器以形成真蝦類精子發(fā)生中出現(xiàn)的臨時細(xì)胞器片層復(fù)合體(LCx),最終幫助成熟精子中外翻的傘狀頂體的形成和盤狀細(xì)胞核的變形。第二部分十足目爬行亞目中華絨螯蟹精子發(fā)生過程中p53參與的生精細(xì)胞凋亡研究為了研究十足目甲殼動物正常生精過程中的的保護(hù)機(jī)制,我們從中華絨螯蟹精巢組織中克隆了p53同源基因。對其序列分析結(jié)果顯示,該p53同源基因具有保守的DNA結(jié)合區(qū)域和鋅結(jié)合位點。p53基因在不同組織中的半定量分析結(jié)果暗示p53基因的普遍存在性以及其對生命活動的必要性。通過原位雜交實驗檢測了p53基因在精子形成各時期的表達(dá)特征。其基因分布暗示p53可能會對損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)以保證正常的精子發(fā)生,或引發(fā)凋亡以去除不正常的精細(xì)胞。但p53是如何發(fā)揮這些功能的,在未來的工作中我們還需要深入研究。第三部分十足目爬行亞目中華絨螯蟹精子發(fā)生過程中PHB介導(dǎo)的線粒體泛素化研究中華絨螯蟹的精子含有杯狀核,核杯開口處有數(shù)個線粒體深陷核內(nèi),頂體囊片層結(jié)構(gòu)中鑲嵌有線粒體衍生物。該線粒體分布模式的形成過程包含線粒體數(shù)量消減、結(jié)構(gòu)變化及其運輸過程。精細(xì)胞中線粒體數(shù)量的消減可通過自噬和泛素化等降解途徑實現(xiàn)。為研究甲殼動物精子發(fā)生過程線粒體的泛素化降解機(jī)制,我們關(guān)注一種線粒體內(nèi)膜蛋白Prohibitin(PHB)。該蛋白在進(jìn)化上高度保守,它與哺乳動物的精子發(fā)生過程以及精子質(zhì)量控制高度相關(guān)。在哺乳動物中它被發(fā)現(xiàn)作為泛素的底物,可能通過參與線粒體的泛素-蛋白酶體途徑(UPP)來發(fā)揮作用。為研究PHB蛋白是否介導(dǎo)精子線粒體的泛素化途徑,我們通過原核表達(dá)、重組蛋白純化、家兔免疫以及抗體純化等技術(shù)制備了物種特異性抗體。免疫印跡結(jié)果顯示PHB蛋白在所檢測組織中均有較高表達(dá)。通過免疫熒光實驗檢測了PHB蛋白在精子形成各時期的分布情況,結(jié)果顯示在精子形成早中期頂體形成和精核變形過程中,PHB的表達(dá)量較高,說明PHB可能是通過維持線粒體的功能發(fā)揮作用,為精子形成過程中的頂體形成和細(xì)胞核形變提供充足的能量。PHB和多聚泛素FK2以及線粒體與FK2的共定位實驗顯示：精子形成早中期,PHB、多聚泛素FK2以及線粒體均分布在細(xì)胞的一側(cè),FK2信號比較弱,說明此時PHB和線粒體的泛素化水平比較低；在中后期,PHB、線粒體標(biāo)記物以及FK2信號主要共定位于頂體帽以及細(xì)胞核一側(cè),FK2信號逐漸增強,表明多聚泛素化水平在中后期升高；成熟期精子中,PHB、線粒體標(biāo)記物以及FK2共定位于頂體帽處。實驗結(jié)果暗示在精子形成過程中PHB作為泛素化底物參與線粒體泛素化降解過程,或者多聚泛素鏈通過PHB為底物特異標(biāo)記了線粒體。為進(jìn)一步證明以上結(jié)論,使用shRNA干擾技術(shù)降低PHB表達(dá)和過表達(dá)技術(shù)增加PHB的表達(dá)。干擾組實驗結(jié)果表明PHB表達(dá)量的降低,直接影響多聚泛素水平和線粒體狀態(tài)。過表達(dá)實驗結(jié)果表明PHB的大量表達(dá)使得多聚泛素化水平大幅提升。體外實驗同樣證明PHB作為多聚泛素的底物介導(dǎo)了線粒體的泛素化過程。
【關(guān)鍵詞】：甲殼動物 精子發(fā)生 AFS KIFC 細(xì)胞凋亡 線粒體 泛素化
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q954.4
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 縮略表12-17
• 第一章 文獻(xiàn)綜述17-53
• 1.1 驅(qū)動蛋白KIFC1在精子發(fā)生過程中功能的研究概況17-25
• 1.1.1 引言17-18
• 1.1.2 精子發(fā)生18-21
• 1.1.2.1 哺乳類精子發(fā)生18-19
• 1.1.2.2 甲殼動物精子發(fā)生19-21
• 1.1.3 精子發(fā)生中的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)21-22
• 1.1.4 驅(qū)動蛋白在精子發(fā)生中的功能22-25
• 1.2 泛素化與精子發(fā)生25-37
• 1.2.1 泛素化25-26
• 1.2.2 精子發(fā)生26-27
• 1.2.3 精子發(fā)生過程中的泛素化27-33
• 1.2.4 泛素化在頂體形成中的作用33-34
• 1.2.5 精子在附睪中成熟過程中的泛素化34-35
• 1.2.6 泛素化與睪丸癌的關(guān)系35-36
• 1.2.7 結(jié)論與展望36-37
• 1.3 參考文獻(xiàn)37-53
• 第二章 十足目游泳亞目秀麗白蝦精子形成中的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)及動力學(xué)機(jī)制53-98
• 2.1 引言53-55
• 2.2 實驗材料55-57
• 2.2.1 實驗動物55
• 2.2.2 主要試劑及儀器55-57
• 2.3 實驗方法57-73
• 2.3.1 秀麗白蝦KIFC1基因克隆57-63
• 2.3.2 cDNA序列、多重比對、進(jìn)化樹構(gòu)建以及蛋白結(jié)構(gòu)分析63-64
• 2.3.3 半定量PCR檢測基因在各組織中的表達(dá)64
• 2.3.4 原位雜交64-67
• 2.3.5 原核表達(dá)67-70
• 2.3.6 抗體制作及效價檢驗70
• 2.3.7 免疫印跡70-72
• 2.3.8 免疫熒光72-73
• 2.4 實驗結(jié)果73-90
• 2.4.1 KIFC1序列分析73-76
• 2.4.2 KIFC1蛋白序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析76-77
• 2.4.3 KIFC1蛋白結(jié)構(gòu)77-78
• 2.4.4 Kifc1 mRNA在不同組織中的表達(dá)78-79
• 2.4.5 精子形成中Kifc1基因的時空表達(dá)模式79-81
• 2.4.6 秀麗白蝦KIFC1蛋白體外表達(dá)和蛋白純化結(jié)果81-82
• 2.4.7 秀麗白蝦KIFC1抗體效價檢測結(jié)果82
• 2.4.8 秀麗白蝦KIFC1蛋白在各組織中的鑒定82
• 2.4.9 秀麗白蝦精子形成中KIFC1在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運功能82-85
• 2.4.10 大鼠精子形成中的微管套結(jié)構(gòu)85-86
• 2.4.11 KIFC1運輸?shù)摹柏浳铩?/span>86-90
• 2.5 討論90-93
• 2.5.1 頂體構(gòu)架體與微管套的比較90-91
• 2.5.2 KIFC1可能參與頂體發(fā)生和變形91-93
• 2.6 本章小結(jié)93
• 2.7 參考文獻(xiàn)93-98
• 第三章 中華絨螯蟹精子發(fā)生過程中p53基因功能探索98-126
• 3.1 引言98-99
• 3.2 實驗材料99-101
• 3.2.1 實驗動物99
• 3.2.2 主要試劑及儀器99-101
• 3.3 實驗方法101-111
• 3.3.1 中華絨螯蟹精巢p53基因克隆101-107
• 3.3.2 cDNA序列、多重比對、進(jìn)化樹構(gòu)建以及蛋白結(jié)構(gòu)分析107-108
• 3.3.3 半定量PCR檢測基因在各組織中的表達(dá)108
• 3.3.4 原位雜交108-111
• 3.4 結(jié)果111-119
• 3.4.1 P53序列分析111-112
• 3.4.2 P53蛋白結(jié)構(gòu)112-113
• 3.4.3 P53蛋白序列比對和進(jìn)化分析113-115
• 3.4.4 P53 mRNA在不同組織中的表達(dá)115-116
• 3.4.5 精子發(fā)生過程中P53的時空表達(dá)116-119
• 3.5 討論119-122
• 3.5.1 p53蛋白的特性描述120
• 3.5.2 p53 mRNA的組織表達(dá)120
• 3.5.3 P53在保護(hù)正常精子發(fā)生中的潛在功能,包括引發(fā)DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡120-122
• 3.5.4 p53在成熟精子中的潛在功能122
• 3.6 結(jié)論122
• 3.7 參考文獻(xiàn)122-126
• 第四章 中華絨螫蟹精子發(fā)生過程中PHB介導(dǎo)的線粒體泛素化研究126-169
• 4.1 引言126-129
• 4.2 實驗材料129-130
• 4.2.1 實驗動物129
• 4.2.2 主要試劑及儀器129-130
• 4.3 實驗方法130-142
• 4.3.1 原核表達(dá)130-133
• 4.3.2 抗體制作及效化檢驗133-134
• 4.3.3 免疫印跡134-136
• 4.3.4 免疫熒光136-137
• 4.3.5 體外轉(zhuǎn)染137-142
• 4.4 結(jié)果142-159
• 4.4.1 重組載體構(gòu)建142-143
• 4.4.2 Pet28a-PHB重組蛋白純化143
• 4.4.3 抗體制備-抗體效價以及特異性檢測143
• 4.4.4 中華絨螯蟹PHB蛋白在不同組織中的鑒定143-144
• 4.4.5 精巢中FK2(多聚泛素標(biāo)記物)鑒定144-145
• 4.4.6 PHB在中華絨螯蟹精子形成不同時期的表達(dá)情況145-146
• 4.4.7 PHB與FK2在中華絨螯蟹精子形成不同時期的表達(dá)情況146-148
• 4.4.8 線粒體標(biāo)記物與FK2在中華絨螯蟹精子發(fā)生不同時期的表達(dá)情況148-151
• 4.4.9 線粒體標(biāo)記物與PHB在細(xì)胞中的定位對照151-152
• 4.4.10 shPHB體外干擾152-154
• 4.4.11 es-phb基因體外過表達(dá)實驗154-155
• 4.4.12 shPHB138干擾后線粒體、PHB泛素化水平檢測155-158
• 4.4.13 ES-PHB蛋白體外過表達(dá)對多聚泛素化的影響158-159
• 4.5 討論159-163
• 4.5.1 PHB在甲殼動物精子頂體形成和細(xì)胞核形變中的作用160-161
• 4.5.2 在精子形成時期PHB介導(dǎo)了線粒體的泛素化161-163
• 4.6 本章小結(jié)163
• 4.7 參考文獻(xiàn)163-169
• 第五章 總結(jié)與展望169-171
• 附件Ⅰ171-172
• 附件Ⅱ172-180
• 附件Ⅲ180-185

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 堵南山,薛魯征,賴偉;中華絨螯蟹精子的研究 Ⅱ.精子發(fā)生[J];海洋與湖沼;1988年01期

2 林勤武,劉瑞玉,相建海;中國對蝦精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化功能的研究Ⅰ.精子的超顯微結(jié)構(gòu)[J];海洋與湖沼;1991年05期

3 林抒豪;石玉秀;韓芳;;細(xì)胞凋亡與真核細(xì)胞骨架蛋白相關(guān)性的研究進(jìn)展[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2015年02期

4 楊萬喜;日本沼蝦三種細(xì)胞器在精子發(fā)生過程中變化的研究[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報;1998年01期

  本文關(guān)鍵詞：十足目甲殼動物頂體構(gòu)架體及精子發(fā)生相關(guān)蛋白功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：255975