本文關(guān)鍵詞：J亞群禽白血病病毒受體的分離鑒定及研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禽白血病病毒(avian leukosis virus, ALV)可以致禽發(fā)生多種類型的腫瘤,屬于反轉(zhuǎn)錄病毒。根據(jù)病毒囊膜蛋白的抗原性,分為A-J等10個亞群,其中A, B, C, D, E和J亞群能夠感染雞。J亞群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J, ALV-J)是1980年代由Payne等[1]人從肉雞中首次分離鑒定。反轉(zhuǎn)錄病毒env囊膜蛋白含有兩個表面亞單位：一個是SU蛋白(surface unit, SU),另外一個是TM蛋白。SU蛋白含有病毒-受體相互作用的決定簇,能夠介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合,是決定宿主范圍的關(guān)鍵因素,病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合是啟動病毒感染的第一步,也是最為關(guān)鍵的一步。病毒粒子一旦與受體結(jié)合,即會激活病毒與細(xì)胞的融合。在反轉(zhuǎn)錄病毒中,目前已被鑒定的病毒受體已有很多。例如,貓免疫缺陷病毒(Feline Immunodeficiency Virus, FIV)利用CD4和CD134作為感染宿主細(xì)胞的主要受體[’]；人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)利用CD4、CCR5和CXCR4分別作為主要受體和共受體[2]感染人CD4 T細(xì)胞；同時,CD4、CCR5和CXCR4亦作為猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus, SIV)的受體參與SIV的感染過程。然而,SIV卻廣泛地使用各種共受體分子介導(dǎo)病毒感染,例如：CCR1、CCR2b、CCR3、CCR8、GPR1、 GPR15以及其他多種細(xì)胞因子受體。這些病毒受體的鑒定為深入研究、了解病毒感染機(jī)制和為人類控制疾病發(fā)揮了很好的作用。到目前為止,禽白血病病毒受體分離鑒定研究中,已有四種受體蛋白得到鑒定,分別是Tva, Tvb, Tvc和chNHE1。其中,Tva, Tvc和chNHEl分別介導(dǎo)A亞群,C亞群和J亞群禽白血病病毒的感染,而Tvb負(fù)責(zé)編碼B亞群,D亞群和E亞群禽白血病病毒受體。禽白血病病毒曾經(jīng)作為分析病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的模型用于病毒感染研究,發(fā)揮了很好的作用。然而,本世紀(jì)初禽白血病尤其是J亞群禽白血病的感染發(fā)生很大變化,尤其是在中國出現(xiàn)嚴(yán)重問題,ALV-J從肉用雞群發(fā)展到蛋雞群,中國的一些地方品種雞群也可以感染；由單獨(dú)引起病雞發(fā)生髓細(xì)胞瘤、血管瘤發(fā)展至可同時引起病雞的血管瘤、髓細(xì)胞瘤,甚至引發(fā)病雞同時產(chǎn)生血管瘤、髓細(xì)胞瘤和平滑肌瘤;近幾年,相繼有報道指出ALV-J在雞體內(nèi)與其他免疫抑制病毒(如MDV[13]、REV[14])發(fā)生共感染現(xiàn)象。這些現(xiàn)象的發(fā)生一方面可能是由于在自然選擇壓下,env基因可變區(qū)的快速變異或基因重組導(dǎo)致病毒毒力和致瘤性的增強(qiáng)以及宿主感染范圍的擴(kuò)大,但更重要的可能是在病毒的感染上存在新的受體。當(dāng)然,ALV-J gp85基因序列不同程度的變異也可能會導(dǎo)致ALV-J的組織嗜性和細(xì)胞受體類型發(fā)生變化,繼而影響到宿主的范圍。為此,本研究利用J亞群禽白血病病毒為模型,通過免疫共沉淀、質(zhì)譜分析、熒光定量PCR等技術(shù)進(jìn)行了ALV-J新受體的分離鑒定和特性分析。1.ALV-J gp85基因和兔IgGFc基因在腺病毒表達(dá)系統(tǒng)中的融合表達(dá)首先將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的SUJ-rIgGFc基因克隆進(jìn)pShuttle-CMV載體中,構(gòu)建腺病毒重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-SUJ-rIgGFc;重組質(zhì)粒經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1感受態(tài)細(xì)胞,在感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)與腺病毒骨架pAdEasy-1同源重組及抗性篩選獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-SUJ-rIgGFc;重組腺病毒質(zhì)粒pAd-SUJ-rIgGFc經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)染人293T細(xì)胞獲得重組腺病毒rAd-SUJ-rIgGFc。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和免疫熒光試驗(yàn)(FA)分析并證明目的基因SUJ-rIgGFc通過腺病毒表達(dá)載體在293T細(xì)胞中得到很好地表達(dá),且融合蛋白主要分布于293T細(xì)胞膜,可被ALV-J特異性單克隆抗體JE9和羊抗兔IgG所識別；Western blot試驗(yàn)結(jié)果表明,融合蛋白大小在90-95kd左右,與JE9以及羊抗兔IgG均有很好的反應(yīng)性。同時,將重組病毒感染MDCK細(xì)胞,利用免疫熒光試驗(yàn)分析,表明重組病毒能夠感染MDCK細(xì)胞,融合蛋白在MDCK細(xì)胞中表達(dá)良好。本研究利用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)在人293T細(xì)胞成功融合表達(dá)了ALV-J gp85基因和兔IgG Fc基因,獲得了能夠表達(dá)目的基因的重組病毒；同時,通過MDCK擴(kuò)增重組病毒,收獲并純化融合蛋白,為下一步分離ALV-J受體提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。2.J亞群禽白血病病毒受體的分離鑒定和質(zhì)譜分析利用DF1細(xì)胞系和pcDNA-env DF1細(xì)胞系作為受體供體細(xì)胞,為免疫共沉淀試驗(yàn)提供目的蛋白,同時采用兩種方案進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)。方案一,將DF1細(xì)胞膜蛋白與融合蛋白SUJ-rlgGFc、protein A agarose進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn),沉淀產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和銀染后,切膠并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。方案二,pcDNA-env DF1細(xì)胞經(jīng)裂解后分離膜蛋白,與抗ALV-Jenv蛋白單克隆抗體JE9、protein A agarose resin進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn),沉淀洗脫蛋白經(jīng)SDS-PAGE和銀染后,切膠,進(jìn)行質(zhì)譜分析。SDS-PAGE結(jié)果顯示,兩種方案獲得的免疫共沉淀產(chǎn)物中均得到約80kd和38kd的兩個蛋白條帶。經(jīng)質(zhì)譜分析,這兩種蛋白分別是78kd葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulated Protein, GRP78)和膜聯(lián)蛋白A2 (annexin,ANXA2)。提示,本研究分離的能夠與ALV-J SU蛋白特異結(jié)合蛋白是ALV-J疑似受體,為進(jìn)一步鑒定和驗(yàn)證疑似受體奠定了基礎(chǔ)。3.GRP78和ANXA2在J亞群禽白血病病毒感染中的功能分析通過抗GRP78多抗和抗ANXA2多抗在DF1細(xì)胞中進(jìn)行感染抑制試驗(yàn),以檢驗(yàn)GRP78和ANXA2在J亞群禽白血病病毒粒子進(jìn)入靶細(xì)胞或在早期感染過程中是否發(fā)揮著受體的功能。首先,利用抗GRP78和抗ANXA2多抗封閉DF1細(xì)胞表面GRP78和ANXA2,然后用ALV-J感染DF1細(xì)胞,并用甘氨酸處理滅活細(xì)胞外的病毒粒子,48小時后通過間接免疫熒光試驗(yàn)、免疫印跡試驗(yàn)、熒光定量PCR分別檢測細(xì)胞中ALV-J env的表達(dá)水平,同時通過測定細(xì)胞上清中的ALV-J的TCID50鑒定病毒效價,從而判定抑制病毒感染的效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)多抗封閉的DF1細(xì)胞中ALV-J env的表達(dá)水平均有所下降。病毒滴度測定結(jié)果顯示,當(dāng)抗體濃度達(dá)到50μg/mL時,抗GRP78多抗和抗ANXA2多抗對病毒感染的抑制率分別可達(dá)到93.2%和98.4%；IFA和Western blot結(jié)果顯示,隨著阻斷抗體濃度的加大,DF1細(xì)胞中ALV-J env蛋白表達(dá)越來越少,病毒滴度也顯著降低,而作為對照,抗體對ALV-A的感染無抑制作用。結(jié)果表明,病毒感染所需的受體被特異性抗體所封閉,啟動病毒感染的第一步即病毒與受體的結(jié)合被有效阻斷,從而導(dǎo)致病毒感染率的下降。本研究中,細(xì)胞表面GRP78和ANXA2的缺失是導(dǎo)致ALV-J感染率的急劇下降甚至出現(xiàn)ALV-J的感染失敗的根本原因,表明GRP78和ANXA2是ALV-J的受體。4.J亞群禽白血病病毒受體chGRP78和chANXA2重建試驗(yàn)chGRP78和chANXA2作為J亞群禽白血病病毒受體,能夠介導(dǎo)ALV-J進(jìn)入宿主細(xì)胞從而啟動病毒感染。那么,如果在非易感細(xì)胞表面建立同樣的受體模型,ALV-J是否還能感染非易感細(xì)胞?或者,chGRP78和chANXA2是否還具有介導(dǎo)ALV-J進(jìn)入非易感細(xì)胞的功能?為此,本研究利用人胚腎細(xì)胞(HEK293T細(xì)胞)和鵝胚成纖維細(xì)胞(GEF)作為受體重建靶細(xì)胞,以DF1細(xì)胞總RNA為模板擴(kuò)增chGRP78和chANXA2基因全序列,并構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-chGRP78和pcDNA3.1-chANXA2。chGRP78和chANXA2分別或共同轉(zhuǎn)染GEF或293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48小時候后感染ALV-J (M.O.I=5),并于感染后不同時間點(diǎn)收獲細(xì)胞,通過間接免疫熒光試驗(yàn)或熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)ALV-J env的表達(dá)。ALV-J (M.O.I=5)感染表達(dá)chGRP78和/或chANXA2的GEF細(xì)胞,病毒吸附2小時候甘氨酸(Ph3.0)滅活未進(jìn)入細(xì)胞的病毒粒子,48小時候收獲GEF細(xì)胞并裂解,將細(xì)胞裂解物接種DF1細(xì)胞,培養(yǎng)7天后,利用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測病毒增殖情況。IFA結(jié)果顯示,共表達(dá)chGRP78和chANXA2的GEF細(xì)胞以及表達(dá)chANXA2的GEF細(xì)胞裂解物接種的DF1細(xì)胞均能產(chǎn)生可見的特異性熒光,而表達(dá)chGRP78或空載體的GEF細(xì)胞裂解物接種的DF1細(xì)胞未見特異性熒光,說明chANXA2和chGRP78在GEF細(xì)胞中的表達(dá)有效地介導(dǎo)并協(xié)助了病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞,完成了病毒感染關(guān)鍵的第一步：而在兩個受體之間,chANXA2應(yīng)該較chGRP78承擔(dān)著更為主要的作用或角色。同時,表達(dá)chGRP78或chANXA2的293T細(xì)胞在感染ALV-J后，通過real-time PCR檢測感染后12h、24h、48h和72h四個時間點(diǎn)293T細(xì)胞內(nèi)ALV-J env基因的相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示,表達(dá)chGRP78或chANXA2的293T細(xì)胞內(nèi)ALV-J env基因的相對表達(dá)水平相對空載體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞要高得多。在感染后48小時內(nèi),表達(dá)chGRP78的293T細(xì)胞中ALV-J env基因的相對表達(dá)水平出現(xiàn)上升,并于48小時達(dá)到最高值；表達(dá)chANXA2的293T細(xì)胞中ALV-J env基因的相對表達(dá)水平在72h出現(xiàn)持續(xù)上升趨勢；而共表達(dá)chGRP78和chANXA2的293T細(xì)胞中env的相對表達(dá)水平亦呈現(xiàn)上升趨勢,并在48h達(dá)到最高。研究結(jié)果表明,chGRP78和chANXA2在293T細(xì)胞中獲得表達(dá),且ALV-J env的mRNA相對表達(dá)水平呈現(xiàn)動態(tài)變化的過程,說明ALV-J病毒粒子確實(shí)能夠借助293T細(xì)胞表面表達(dá)的chGRP78或chANXA2進(jìn)入細(xì)胞,證明兩種蛋白對介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞確實(shí)發(fā)揮了重要作用；而比較293T細(xì)胞的熒光定量PCR結(jié)果可見,與chGRP78相比較,chANXA2在病毒感染中應(yīng)該發(fā)揮著更為主要的作用。
【關(guān)鍵詞】：J亞群禽白血病病毒 受體 分離 鑒定 受體重建
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• ABSTRACT8-14
• 符號說明14-16
• 第一章 文獻(xiàn)綜述16-28
• 1 禽白血病病原學(xué)16-22
• 2 ALV的流行病學(xué)22-24
• 3 我國禽白血病的流行現(xiàn)狀24-27
• 4 禽白血病的控制與消滅27-28
• 研究一 ALV-J SU與兔IGG FC基因在腺病毒表達(dá)系統(tǒng)中的融合表達(dá)28-44
• 1 材料29-30
• 2 方法30-37
• 3 結(jié)果37-41
• 4 討論41-44
• 研究二 J亞群禽白血病病毒受體的分離鑒定及質(zhì)譜分析44-54
• 1 材料45
• 2 方法45-48
• 3 結(jié)果48-51
• 4 討論51-54
• 研究三 J亞群禽白血病病毒受體的鑒定和分析54-68
• 1 材料55
• 2 方法55-59
• 3 結(jié)果59-66
• 4 討論66-68
• 研究四 J亞群禽白血病病毒受體GRP78和ANXA2的重建試驗(yàn)68-89
• 1 材料69-70
• 2 材料70-79
• 3 結(jié)果79-86
• 4 討論86-89
• 參考文獻(xiàn)89-94
• 附錄94-102
• 致謝102-103
• 攻讀學(xué)位期間的成果103-105

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王維新,史成銀,高天翔,黃P";鑒定病毒受體的研究方法[J];海洋湖沼通報;2005年01期

2 張淑琴;馬學(xué)恩;周建華;;病毒受體研究進(jìn)展[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2008年07期

3 趙清;李冬;;病毒受體及其研究現(xiàn)狀[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2009年07期

4 趙孟孟;潘俊斌;王衡;;獸醫(yī)科學(xué)中病毒受體的研究進(jìn)展[J];廣東畜牧獸醫(yī)科技;2010年03期

5 王睿;宋幸輝;王選年;鮑登克;王寅彪;張改平;;病毒受體研究技術(shù)進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年06期

6 高順平;吳國華;張強(qiáng);;病毒受體及其研究進(jìn)展[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2012年02期

7 田獻(xiàn)禮;王選年;寧紅梅;朱艷平;李鵬;銀梅;岳鋒;;病毒受體及其研究方法概況[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2012年03期

8 徐如良;用單克隆抗體技術(shù)研究病毒受體的新進(jìn)展[J];中國免疫學(xué)雜志;1987年06期

9 陳火勝;病毒受體及其研究意義[J];自然雜志;1989年06期

10 李明遠(yuǎn);;病毒感染與病毒受體[J];病毒學(xué)雜志;1989年03期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 李志杰;丁壯;高恩鵬;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒受體研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

2 宋戰(zhàn)昀;韓文瑜;丁壯;;麻疹病毒細(xì)胞膜受體研究進(jìn)展[A];全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

3 宋戰(zhàn)昀;韓文瑜;丁壯;;麻疹病毒細(xì)胞膜受體研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第六屆理事會第二次會議暨教學(xué)專業(yè)委員會第六屆代表大會論文集[C];2006年

4 馬明;劉月煥;陳明勇;韓春華;林健;;虎呼吸道和消化道上皮細(xì)胞表面流感病毒受體種類的測定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十四次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

5 安同慶;周艷君;賀云霞;田志軍;徐靈龍;仇華吉;王云峰;童光志;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒受體結(jié)合域的初步鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2006學(xué)術(shù)年會論文集（下冊）[C];2006年

6 馬明;劉月煥;陳明勇;韓春華;林健;;鴿呼吸道和消化道黏膜上皮細(xì)胞表面流感病毒受體類型的檢測[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2009學(xué)術(shù)年會論文集（下冊）[C];2009年

7 冉偉;孫藝學(xué);朱利塞;丁壯;叢彥龍;;豬H3N2亞型流感病毒受體親和性鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2013年

8 宋戰(zhàn)昀;馮新;丁壯;韓文瑜;;NA-1和F_(48)E_9病毒受體在不同禽類組織水平的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十四次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 記者　韓建清;SARS病毒受體找到了[N];人民日報;2006年

2 記者　 張景華 吳春燕;中國科學(xué)家首次證實(shí)人體存在SARS病毒受體[N];光明日報;2006年

3 記者 吳月輝 趙永新;我科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)乙肝病毒受體[N];人民日報;2012年

4 通訊員　鄒瑩 張淼 記者　于莘明;我科學(xué)家首次證實(shí)人體存在SARS病毒受體[N];科技日報;2006年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 劉利兵;日本乙型腦炎病毒受體的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);1994年

2 梅梅;J亞群禽白血病病毒受體的分離鑒定及研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

3 張淑琴;馬傳染性貧血病毒受體選擇剪接變異體的鑒定及功能性研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 高順平;山羊痘病毒受體的篩選及受體結(jié)合蛋白初步研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

2 劉華蘭;牛β干擾素克隆、表達(dá)和雞傳染性支氣管炎病毒受體鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

3 張元鵬;趨化因子類病毒受體的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 楊旭艷;馬慢病毒受體1插入型選擇性剪接體的原核表達(dá)[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

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本文編號：254032