【摘要】：本論文包括碩博連讀期間的兩個(gè)研究項(xiàng)目,分別圍繞HBoV1感染性克隆的構(gòu)建和HBoV1對(duì)天然免疫的調(diào)節(jié)展開。第一部分,我們成功構(gòu)建了插入了EGFP基因的全長(zhǎng)HBoV1感染性克隆(pIHBoV1wh-GFP)。感染性克隆的構(gòu)建,是開展基礎(chǔ)病毒學(xué)研究的基礎(chǔ)工作。在這篇文章中,我們首先構(gòu)建了武漢株博卡病毒的感染性克隆pIHBoV1wh。并驗(yàn)證了pIHBoV1wh在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和產(chǎn)生病毒粒子的能力。同時(shí),我們構(gòu)建了插入了EGFP基因的全長(zhǎng)HBoV1克隆pIHBoV1wh-GFP。pIHBoVwh-GFP能夠在轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄、翻譯、復(fù)制和產(chǎn)生子代病毒(HBoV1wh-GFP),并且包裝的病毒基因組是全長(zhǎng)的。由于EGFP蛋白高度靈敏,易于檢測(cè),因此為尋找新的易感宿主提供了有力工具。同時(shí),可以作為轉(zhuǎn)基因治療的載體,攜帶更大的基因,用于治療肺部疾病。第二部分,我們證明了HBoV1 NS1、NS1-70蛋白可以抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。HBoV1屬于細(xì)小病毒科,是在世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒急性呼吸道感染的單鏈DNA病原體。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)激活許多生理過(guò)程在入侵病毒的清除中發(fā)揮關(guān)鍵作用。以前的研究表明,HBoV1感染可以顯著上調(diào)TNF-α的水平,而TNF-α是NF-κB信號(hào)通路的強(qiáng)刺激物。我們這篇文章主要探索HBoV1蛋白是否調(diào)節(jié)TNF-α介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活。我們發(fā)現(xiàn)HBoV1 NS1和NS1-70蛋白抑制TNF-α刺激的NF-κB激活。NS1和NS1-70蛋白可以抑制TNF受體相關(guān)因子2(TRAF2)、IκB激酶α(IKKα)、IκB激酶β(IKKβ)、IKKβ持續(xù)性激活型突變體(IKKβSS/EE)或p65-誘導(dǎo)的NF-κB激活。此外,NS1和NS1-70不抑制TNF-α介導(dǎo)的IκBα磷酸化和降解,也不抑制p65的入核。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)NS1和NS1-70與p65的相互作用。值得注意的是,NS1抑制TNF-α介導(dǎo)的p65 ser536位點(diǎn)磷酸化,而NS1-70不抑制。我們的研究結(jié)果揭示HBoV1 NS1和NS1-70蛋白抑制NF-κB激活。我們證明HBoV1可以抑制NF-κB信號(hào)通路激活,為揭示HBoV1的免疫逃避機(jī)制,探索其致病性提供了重要依據(jù)。
【圖文】：

3圖 1.1 細(xì)小病毒科各個(gè)屬的進(jìn)化樹分析。基于病毒復(fù)制起始蛋白 NS1 的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析。FIG 1.1 Phylogenetic tree showing genera in the family Parvoviridae. Phylogenetic analysis basedon the amino acid sequence of the viral replication initiator protein, NS1.1.2.2 HBoV 的形態(tài)和結(jié)構(gòu)HBoV 是立體對(duì)稱的二十面體，直徑約 20-26 nm，外側(cè)無(wú)囊膜包被（圖 1.2）(4)。HBoV 的基因組是單股負(fù)義 DNA，全長(zhǎng) 5543 個(gè)核苷酸。所有脊椎動(dòng)物的細(xì)小病毒都含有相似的基因組結(jié)構(gòu)，，含有用于基因組復(fù)制的末端重復(fù)序列（發(fā)夾結(jié)構(gòu)），非結(jié)構(gòu)蛋白在基因組的左側(cè)，結(jié)構(gòu)蛋白在基因組的右側(cè)(5)。通過(guò)昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)的衣殼蛋白 VP2 可以自組裝成病毒樣顆粒（VLP）(6)，人們常用 VLP

圖 1.2 HBoV 的二十面體結(jié)構(gòu)。（A）（電子顯微鏡）用 4％乙酸雙氧鈾負(fù)染鼻咽樣品中 HBoV的 EM 照片，放大倍數(shù)×60,000。（B）通過(guò)氯化銫超速離心從 bacVP2/HBoV 感染的 High-5細(xì)胞裂解物中純化的 HBoV VP2（病毒樣顆粒）VLP。純化的 VP2 蛋白用 2％磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染用于 EM 分析。（C）HBoV 衣殼結(jié)構(gòu)。HBoV 表面表示低溫重建的結(jié)構(gòu)。HBoV 的分辨率為（7.9 ）。FIG 1.2 the structure of HBoV. (A) (electron microscopy) EM of HBoV in Nasopharyngealsamples after negative staining with 4% uranyl acetate, observed at ×60,000. (B) HBoV VP2(Virus-like Particles) VLPs purified from lysates of High-5 cells infected with bacVP2/HBoV bycesium chloride ultracentrifugation. Fractions containing VP2 proteins were prepared for EManalysis by negative staining with 2% phosphotungstic acid. (C) HBoV capsid structures. Stereo,radially color-cued, surface representation of HBoV cryo-reconstruction. HBoV are rendered atthe resolution (7.9 ).
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R373;Q78

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1 劉慶世;人博卡病毒（HBoV1）感染性克隆的構(gòu)建及其NS1和NS1-70蛋白對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[D];中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所;2017年

本文編號(hào)：2524467