【摘要】：近年來,單分子技術(shù)在分子生物學領域發(fā)揮了巨大的作用。作為單分子操縱術(shù)中的磁鑷技術(shù)因為構(gòu)建方便,精度較高而受到青睞。但當磁力小于10 p N時,傳統(tǒng)磁鑷的分辨率會受到磁球布朗運動的限制。為了提高磁鑷的分辨率,我們把全內(nèi)反射熒光技術(shù)引入到磁鑷系統(tǒng)中,我們同時發(fā)展了一種新的單分子連接系統(tǒng):“磁球-手柄-熒光球-待測底物”。改進的磁鑷可以實現(xiàn)小力下納米精度的空間分辨率,同時在長時間觀測中保持較高的時間分辨率。G-四聚體(G-quadruplex;G4)是廣泛存在于細胞基因組中的一種DNA結(jié)構(gòu),在DNA的代謝如復制、轉(zhuǎn)錄、同源重組等過程中起重要作用。隨著單分子技術(shù)的發(fā)展,越來越多的的關(guān)于G4的研究被發(fā)表,但是一些基本的問題還不是很清楚。G4解旋酶近年來受到廣泛研究,其中BLM解旋酶的研究已經(jīng)相當豐富。BLM解旋酶在同源重組修復過程中維持了基因的穩(wěn)定性,研究表明BLM可以高效的結(jié)合和解旋G4。我們應用全內(nèi)反射瞬逝場照明磁鑷對BLM解旋G4的動力學過程進行深入研究,觀察到了BLM解旋G4的分步過程。相對于單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)而言,磁鑷的長時間觀測能力使我們在近飽和ATP濃度的實驗體系中觀察到BLM長時間反復解開G4或者長時間維持G4在打開狀態(tài)的兩種作用方式。我們使用相同的實驗條件作了單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗,確定了加載2-3 pN的外力不會對BLM解旋G4的過程產(chǎn)生影響。通過對BLM解旋G4后G4去折疊態(tài)的駐留時間的研究,我們發(fā)現(xiàn)BLM解旋G4的過程對應于一個長駐留時間過程和一個短駐留時間過程。我們發(fā)現(xiàn)ATP水解和HRDC結(jié)構(gòu)域同單鏈DNA的結(jié)合是BLM解旋G4的長駐留時間過程的原因。我們的數(shù)據(jù)讓我們提出了HRDC對BLM解旋G4過程影響的模型。當HRDC和G4序列相結(jié)合時,BLM可以使G4長時間保持非折疊態(tài);當HRDC處于自由態(tài)時,BLM就會快速的重復解旋G4。
[Abstract]:In recent years, monomolecular technology has played an important role in the field of molecular biology. As a monomolecular manipulation technique, magnetic tweezers are favored because of their convenient construction and high precision. However, when the magnetic force is less than 10 PN, the resolution of the traditional tweezers will be limited by the Brownian motion of the magnetic sphere. In order to improve the resolution of magnetic tweezers, we introduced the total internal reflection fluorescence technique into the magnetic tweezers system. At the same time, we developed a new monomolecular joining system: magnetic sphere-handle-fluorescent sphere-substrate to be measured. The improved magnetic tweezers can achieve the spatial resolution of nano-precision under small force while maintaining a high temporal resolution in long-time observation. G-tetramer (G-tetramer); G4) is a kind of DNA structure which widely exists in the cell genome. It plays an important role in the metabolism of DNA such as replication transcription homologous recombination and so on. With the development of monomolecular technology, more and more researches on G4 have been published, but some basic problems are still unclear. G4 racemases have been extensively studied in recent years. Among them, the study of BLM helicase has been quite abundant. BLM helicase has maintained the gene stability in homologous recombination repair process. The results show that BLM can efficiently bind and decompose G4. The results show that BLM can efficiently bind and decompose G4 gene in the process of homologous recombination repair. The kinetic process of BLM de-spin G _ 4 was studied deeply by using the total internal reflection transient field illumination tweezers. The step-by-step process of BLM de-spin G _ 4 was observed. Compared to the single molecule fluorescence resonance energy transfer technique, The ability of long-term observation of magnetic tweezers led us to observe two ways of BLM repeatedly unlocking G4 or maintaining G4 in open state for a long time in the experimental system of near-saturated ATP concentration. We use the same experimental conditions to do a single molecule fluorescence resonance energy transfer experiment, and it is determined that the external force loading of 2 ~ 3 pN will not affect the process of BLM de-spin G _ 4. By studying the residence time of the de-folded state of G4 after BLM de-spin, it is found that the process of BLM de-rotating G4 corresponds to a process of long residence time and a process of short residence time. It is found that ATP hydrolysis and the binding of HRDC domain with single strand DNA are the reasons for the long residence time of BLM despin G4. Our data allow us to propose a model of the effect of HRDC on the BLM de-spin G4 process. When HRDC and G4 sequences are combined, BLM can keep G4 in non-folded state for a long time, and when HRDC is in free state, BLM will rapidly repeat G4.
【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院物理研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q6-3

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