【摘要】：納米二氧化硅是使用量最多的納米材料之一,具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性,在制藥、醫(yī)療、生物科技等方面具有廣泛應(yīng)用,這增加了生物體與其接觸的機會。有研究報導(dǎo)塵肺病等疾病的產(chǎn)生與長期接觸二氧化硅納米顆粒(SiO_2 NP)有關(guān),但是其致病機理仍不明確。SiO_2NP與細胞膜的直接接觸是導(dǎo)致細胞毒性的重要途徑。因此,本論文對SiO_2NP與細胞膜的相互作用進行了深入研究。細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和相態(tài)的流動性是細胞進行正常生命活動的必要條件,本論文基于細胞膜這兩個與功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)特點探究了納米顆粒對細胞膜完整性和相態(tài)流動性的影響。由于細胞的代謝活動會干擾對納米顆粒與細胞膜界面作用的認識,本論文采用人工生物膜——大單層囊泡(GUV)和小單層囊泡(SUV)作為細胞膜模型,研究不同分散狀態(tài)以及表面修飾的Si02NP對細胞膜的影響。此外,本論文還從RBL-2H3細胞中提取了質(zhì)膜囊泡(GPMV)作為介于真實細胞膜和人工生物膜之間的細胞膜模型,從分子水平討論了納米顆粒改變細胞膜相態(tài)的機理,進一步完善了關(guān)于納米顆粒與細胞膜界面作用的認識,為納米材料的安全使用提供重要信息。1.SiO_2等納米氧化物對模擬細胞膜結(jié)構(gòu)和流動性的影響本研究比較了 SiO_2 NP及其它四種常用的納米氧化物Al_2O_3、Fe_2O_3、TiO_2、ZnO與模擬細胞膜的界面作用。實驗結(jié)果表明,在靜電作用下Al_2O_3和SiO_2NP破壞了帶有相反電性的細胞膜完整性。然而Fe_2O_3、TiO_2和ZnONP并沒有對細胞膜造成明顯的破壞。將相態(tài)指示探針Laurdan加入模擬細胞膜中,其熒光光譜表明SiO_2 NP能夠使細胞膜向膠態(tài)化轉(zhuǎn)變。而Al_2O_3和ZnO NP僅使電性相反的細胞膜向膠態(tài)化轉(zhuǎn)變。通過傅里葉紅外光譜技術(shù)(FT-IR)探究納米顆粒對磷脂分子結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果表明Al_2O_3和SiO_2NP會結(jié)合磷脂分子的羰基或者磷酸基團形成氫鍵。其中,SiO_2NP與細胞膜之間的氫鍵作用更強。因此,氫鍵作用使Al_2O_3和SiO_2NP破壞了細胞膜的結(jié)構(gòu),改變了細胞膜的相態(tài)。2.不同分散狀態(tài)和表面修飾的SiO_2 NP對磷脂層的影響由于SiO_2NP對細胞膜造成的損傷更為嚴重,選取不同分散狀態(tài)及表面修飾的SiO_2NP,深入探討了 SiO_2NP對模擬細胞膜GUV結(jié)構(gòu)和相態(tài)的影響。研究發(fā)現(xiàn)靜電吸引促進顆粒與磷脂分子之間形成氫鍵,幾種不同的SiO_2 NP均對相反電性GUV的形態(tài)破壞更嚴重,但對電性相同的GUV破壞作用較弱。增加SiO_2 NP的暴露時間和劑量加劇了膜損傷。此外,由于納米顆粒易沉積增大了顆粒物與GUV的接觸機率,快速沉降的SiO_2NP粉末對GUV破壞程度要強于穩(wěn)定分散的SiO_2 NP膠體。相態(tài)指示探針Laurdan的熒光光譜表明負電的SiO_2 NP引起細胞膜的膠態(tài)化;而經(jīng)過表面修飾帶正電的SiO_2 NP對正電性和電中性的GUV的相態(tài)影響不明顯,但是能夠使電負性的GUV向膠態(tài)移動。3.SiO_2 NP吸附腐殖酸和蛋白質(zhì)后對細胞膜的影響SiO_2 NP排放進入環(huán)境后會帶來健康風(fēng)險。SiO_2 NP在自然界中容易吸附腐殖酸(HA)等天然有機物,在人體體液中則容易吸附蛋白質(zhì)等生物分子,這會改變顆粒的表面性質(zhì)和生物毒性,從而影響SiO_2 NP與細胞膜之間的相互的作用。因此牛血清蛋白(BSA)和腐殖酸被用來處理SiO_2 NP(BSA-SiO_2 NP和HA-Si02 NP),探究吸附BSA或HA后的SiO_2 NP對模擬細胞膜完整性和相態(tài)的影響。顯微觀察表明,與裸顆粒相比BSA-和HA-SiO_2 NP對GUV的破壞作用較慢,而BSA-SiO_2 NP對GUV的破壞作用最弱。這是因為BSA和HA覆蓋了 SiO_2 NP表面的Si-OH以及SiO-,從而減弱了 SiO_2NP與磷脂分子之間的相互作用。石英晶體微天平測定表明BSA-SiO_2 NP吸附在未破裂的SUV表面,而HA-SiO_2 NP和裸顆粒則迅速引起SUV破裂。吸附BSA和HA后的Si02 NP對細胞膜相態(tài)的改變不同于裸顆粒,其中HA-SiO_2 NP使細胞膜膠態(tài)化最顯著,而BSA-SiO_2 NP對細胞膜的相態(tài)影響最弱。因此,蛋白質(zhì)能夠有效地減弱SiO_2NP對細胞膜完整性和相態(tài)的影響。4.SiO_2 NP對質(zhì)膜囊泡相態(tài)的影響由于人工生物膜的組成成分與真實細胞膜存在差異,本論文從RBL-2H3細胞中提取質(zhì)膜囊泡作為介于真實細胞膜和人工生物膜之間的細胞膜模型,并研究細胞膜分子組成在Si02NP改變細胞膜相態(tài)過程中的作用。研究發(fā)現(xiàn),用甲基-β-環(huán)糊精去除膜內(nèi)膽固醇的GPMV與SiO_2 NP接觸后,膜相態(tài)向膠態(tài)移動更顯著。實驗使用PFA/DTT和NEM兩種起泡劑刺激細胞起泡制備磷脂組成不同的GPMV。其中PFA/DTT起泡劑會減少細胞膜中的腦磷脂(PE)和磷酸肌醇(PI)的含量,NEM起泡劑制備的GPMV磷脂組分接近原細胞膜。實驗結(jié)果表明,去除PE和PI的GPMV暴露在SiO_2 NP中其相態(tài)向膠態(tài)化轉(zhuǎn)變更顯著。此外,溫度升高時GPMV受SiO_2 NP影響后膠態(tài)化更嚴重。由于細胞生命活動需要隔離的胞內(nèi)空間和流動態(tài)的細胞膜來支持膜蛋白并控制物質(zhì)進出,對細胞膜完整性和流動性的破壞很可能是細胞毒性的重要機制。同時全面了解SiO_2 NP與細胞膜的界面作用,對設(shè)計更安全的納米材料有一定的指導(dǎo)價值。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：X171.5
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本文編號：2431389