【摘要】：斯達(dá)油脂酵母(Lipomyces starkeyi)能利用多樣的碳源發(fā)酵產(chǎn)生油脂,其油含量達(dá)到細(xì)胞干重的60%以上,油脂的脂肪酸組成與植物油類似,有望替代植物油作為生物柴油產(chǎn)業(yè)的新原料。近年來(lái)利用斯達(dá)油脂酵母發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油受到了廣泛的關(guān)注,但是目前利用斯達(dá)油脂酵母發(fā)酵存在油脂產(chǎn)率和培養(yǎng)條件不穩(wěn)定的問題。本研究調(diào)查了斯達(dá)油脂酵母對(duì)不同碳源(包括葡萄糖、木糖、甘油和柳木木屑水解液)的發(fā)酵以及在葡萄糖培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)和油脂的累積規(guī)律；通過基因表達(dá)模式分析、異源表達(dá)和同源重組敲除等方法鑒定斯達(dá)油脂酵母中油脂累積關(guān)鍵基因的功能,并探究了酵母中油脂累積的機(jī)制；展開了斯達(dá)油脂酵母在葡萄糖和木糖作為單一碳源培養(yǎng)時(shí)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,對(duì)木糖代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因進(jìn)行鑒別。通過以上研究以期望為斯達(dá)油脂酵母的菌株改良與工業(yè)上生產(chǎn)放大的條件優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。論文主要研究結(jié)果如下：1.斯達(dá)油脂酵母能利用多種碳源包括葡萄糖、木糖、甘油和柳木木屑水解液進(jìn)行發(fā)酵。當(dāng)以葡萄糖為單一碳源時(shí),C/N越高越能促進(jìn)斯達(dá)油脂酵母的油質(zhì)和飽和脂肪酸(C16：0和C18：0)的累積。斯達(dá)油脂酵母分別使用葡萄糖、木糖、甘油和柳木木屑水解液發(fā)酵時(shí),油含量和油產(chǎn)量分別為47.0%、5.8g/L,36.6%、3.8g/L,46.2%、4.2g/L和42.7%、3.5g/L。由此可知,斯達(dá)油脂酵母能利用木糖、甘油和柳木木屑水解液作為底物進(jìn)行油脂生產(chǎn),但葡萄糖是斯達(dá)油脂酵母油脂生產(chǎn)的適用底物。2.通過調(diào)查對(duì)斯達(dá)油脂酵母在葡萄糖作為單一碳源時(shí)的油脂和干重累積規(guī)律發(fā)現(xiàn),酵母生長(zhǎng)經(jīng)歷適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期,與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)分別為12-h、48-h和96-h,細(xì)胞干重和油含量分別為0.55g/L、17.3%,7.21g/L、33.8%和12.97g/L、45.3%。為了鑒別斯達(dá)油脂酵母控制油含量的關(guān)鍵功能基因,我們根據(jù)油脂累積規(guī)律使用Real-time PCR技術(shù)對(duì)包括L. starkeyi acetyl-CoA carboxylase (LsACC1)基因在內(nèi)的18個(gè)油脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)模式進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)LsACCl、四個(gè)�；o酶A：二脂酰甘油�；D(zhuǎn)移酶基因(DGAT)與油脂的合成密切相關(guān),這為酵母油脂累積的機(jī)制研究提供了分子基礎(chǔ)。3.我們創(chuàng)造性地建立了一種載體構(gòu)建方法Improved restriction digestion-ligation (IRDL),篩選LsACC1進(jìn)行功能鑒定和分析,構(gòu)建了在非油脂酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表達(dá)載體。對(duì)釀酒酵母的油脂累積機(jī)制調(diào)查發(fā)現(xiàn),通過在甘油合成缺陷突變體YA103(甘油-3-磷酸酶GPP1和GPP2都被敲除)中進(jìn)行自身甘油-3-磷酸脫氫酶(GPD1)基因過表達(dá)和飼喂油酸發(fā)現(xiàn),脂肪酸是其油脂累積的主要限制因素,而乙酰輔酶A羧化酶(ACC)基因是脂肪酸合成的關(guān)鍵基因。然后,在釀酒酵母YA103中表達(dá)LsACC1能顯著提高油含量,這說明LsACC1具有ACC酶的功能。為了進(jìn)一步說明油脂累積的機(jī)制,我們構(gòu)建了斯達(dá)油脂酵母的轉(zhuǎn)化體系,然后進(jìn)行LsACC1基因的單等位基因的敲除,結(jié)果基因表達(dá)量顯著下降,油脂含量?jī)H為野生型的一半左右。這說該基因是油脂酵母油脂累積的關(guān)鍵基因。由于L. starkeyi glycerol-3-phosphate dehydrogenase (LsGPD1)在斯達(dá)油脂酵母整個(gè)油脂累積過程表達(dá)量變化不顯著,而該基因又與油脂合成的底物甘油-3-磷酸合成密切相關(guān),說明甘油-3-磷酸在油脂合成過程中是充足的。這些表明無(wú)論在油脂酵母還是非油脂酵母中,脂肪酸都是油脂累積的主要限制因素。為了進(jìn)一步挖掘斯達(dá)油脂酵母油脂合成的其它關(guān)鍵基因,我們克隆了四個(gè)DGAT(LsDGAT11、LsDGAT12、LsDGAT13和LsDGAT2)和一個(gè)LsGPD1基因�；蚪Y(jié)果分析顯示這四個(gè)DGAT基因分為兩種截然不同的功能結(jié)構(gòu)域。利用酵母中性脂合成缺陷型菌株H1246分別異源表達(dá)這四個(gè)DGAT,發(fā)現(xiàn)LsDGAT11和LsDGAT2可恢復(fù)酵母三脂酰甘油(TAG)的合成,LsDGAT12可恢復(fù)酵母固醇酯(SE)的合成,LsDGAT13和非中性脂類的合成相關(guān)。LsDGAT11和LsDGAT2對(duì)TAG累積量的貢獻(xiàn)顯著大于釀酒酵母自身的DGA1。在YA103中表達(dá)LsGPD1,發(fā)現(xiàn)其甘油-3-磷酸含量為釀酒酵母GPD1過表達(dá)含量的3.8倍。說明油脂酵母的DGAT和GPD基因比非油脂酵母的功能更強(qiáng)。4.為了降低微生物的發(fā)酵成本,我們通過RNA-Seq測(cè)序技術(shù)解析斯達(dá)油脂酵母利用木糖的代謝機(jī)制,對(duì)斯達(dá)油脂酵母在葡萄糖或木糖作為單一碳源培養(yǎng)時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序,獲得8191個(gè)基因,其中488個(gè)基因有表達(dá)差異。進(jìn)一步生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)24個(gè)基因與木糖運(yùn)輸相關(guān),10個(gè)基因與木糖的代謝途徑相關(guān),并且大部分基因在木糖培養(yǎng)時(shí)表達(dá)水平顯著上調(diào)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q936

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本文編號(hào)：2424196