【摘要】：二甲基疏基丙酸內(nèi)鹽(Dimethylsulfoniopropionate,DMSP)是全球硫循環(huán)和碳循環(huán)的重要載體物質(zhì)。海洋浮游植物、大型藻類和臨海被子植物是DMSP的主要生產(chǎn)者。每年DMSP的產(chǎn)量可以達(dá)到109噸。在大洋表面的某些區(qū)域,DMSP的產(chǎn)量可以達(dá)到碳固定總量的10%。微生物介導(dǎo)的DMSP的分解代謝是全球硫循環(huán)和碳循環(huán)的重要步驟。海洋玫瑰桿菌類群細(xì)菌(Marine Roseobacter Clade,MRC)是分解代謝DMSP的主要微生物類群之一。微生物利用胞內(nèi)DMSP裂解酶裂解DMSP產(chǎn)生二甲基硫(Dimethyl sulfide,DMS)和丙烯酸(Acrylate)。DMS具有揮發(fā)性,是連接海洋硫庫(kù)和大氣硫庫(kù)的重要媒介。同時(shí),它也是重要的影響氣候的小分子物質(zhì),可以通過(guò)影響地球?qū)μ?yáng)輻射的反射率影響全球氣候環(huán)境。而丙烯酸則是重要的海洋碳源,很多微生物可以利用其作為唯一碳源生長(zhǎng)。研究海洋細(xì)菌對(duì)DMSP的分解代謝對(duì)于更好認(rèn)識(shí)全球硫循環(huán)和碳循環(huán)以及微生物代謝過(guò)程對(duì)環(huán)境的影響具有重要意義。在本論文中,我們以海洋玫瑰桿菌類群細(xì)菌為研究對(duì)象,主要從DMSP裂解酶裂解DMSP的分子機(jī)制、DMSP裂解酶的進(jìn)化機(jī)制、DMSP裂解產(chǎn)物丙烯酸胞內(nèi)代謝的分子機(jī)制以及DMSP分解代謝的動(dòng)力學(xué)調(diào)控機(jī)制等幾個(gè)方面進(jìn)行了研究。1.海洋玫瑰桿菌類群細(xì)菌裂解DMSP產(chǎn)生DMS的分子機(jī)制每年通過(guò)微生物的DMSP裂解酶裂解DMSP產(chǎn)生的DMS可以達(dá)到約3億噸。DMSP裂解酶種類豐富,到目前為止一共發(fā)現(xiàn)了 8種不同的DMSP裂解酶。但DMSP裂解酶裂解DMSP的分子機(jī)制研究較少。DddP是海洋中最豐富的DMSP裂解酶之一,主要來(lái)自于海洋玫瑰桿菌類群細(xì)菌。在本論文中,我們以來(lái)自Ruegeria lacuscaerulensis ITI_1157 的 DMSP 裂解酶 RlDddP 為研究對(duì)象,研究了 DddP催化DMSP裂解的分子機(jī)制。我們首先利用RT-qPCR技術(shù)和酶活檢測(cè)實(shí)驗(yàn)手段驗(yàn)證了 RlDddP的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RldddP基因能夠被DMSP誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),重組表達(dá)純化的RlDddP具有顯著的DMSP裂解酶活性。然后我們檢測(cè)了 RlDddP的酶學(xué)性質(zhì)。RlDddP的最適pH為6.0,最適溫度為60℃,Km值為 17.1 ±0.98mM。鄰菲羅啉(o-phenanthroline,o-P)和 2,2-聯(lián)吡啶(2,2-bipyridine)能夠顯著抑制RlDddP的活性,而典型的金屬螯合劑EDTA和EGTA則對(duì)RlDddP的活性無(wú)顯著影響。然后,我們分別解析了RlDddP結(jié)合底物類似物嗎啉乙磺酸(MES),RlDddP結(jié)合產(chǎn)物類似物磷酸根,RlDddP突變體Y366A結(jié)合產(chǎn)物丙烯酸,RlDddP突變體D377A結(jié)合產(chǎn)物丙烯酸的晶體結(jié)構(gòu)。RlDddP在溶液中以二體形式存在。RlDddP單體有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的夾角約90°,是典型的"pitta-bread"結(jié)構(gòu)。每個(gè)RlDddP二體含有兩個(gè)催化中心,每個(gè)催化中心螯合兩個(gè)Fe3+作為金屬離子輔基,并有10個(gè)保守的氨基酸。其中377位的天冬氨酸位于DMSP的β-C附近,很可能是催化過(guò)程中的親核攻擊堿。突變驗(yàn)證結(jié)果表明突變377位的天冬氨酸會(huì)導(dǎo)致RlDddP酶活的喪失,驗(yàn)證了該氨基酸為攻擊堿的推斷。接著,我們對(duì)已解析的四個(gè)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了疊合分析,發(fā)現(xiàn)RlDddP的二鐵離子輔基中的一個(gè)Fe3+在催化過(guò)程中存在"ion-shift"現(xiàn)象。Fe3+的移動(dòng)有助于DMSP的結(jié)合并且增加了 DMSP的α-H的酸性,是RlDddP實(shí)現(xiàn)催化功能的關(guān)鍵一步。最后,在綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,我們提出了RlDddP裂解DMSP的分子機(jī)制。本研究對(duì)更好的認(rèn)識(shí)微生物裂解DMSP產(chǎn)生丙烯酸釋放DMS的過(guò)程具有重要意義。2.M24金屬蛋白酶來(lái)源的DMSP裂解酶DddP的進(jìn)化機(jī)制序列和基因組分析認(rèn)為DMSP代謝是在其它已存在的代謝途徑的基礎(chǔ)上進(jìn)化產(chǎn)生的。DMSP裂解酶種類豐富,已發(fā)現(xiàn)的DMSP裂解酶分屬于不同的家族。DMSP裂解酶的多樣性暗示著DMSP裂解酶可能具有不同的進(jìn)化來(lái)源。在本論文中,我們以來(lái)源于R.laacuscaerulensis ITI_1157的RlDddP為例,研究了 DddP從金屬蛋白酶進(jìn)化為DMSP裂解酶的機(jī)制。因?yàn)樾蛄蟹治鲲@示DddP屬于M24金屬蛋白酶家族,所以我們首先利用RT-qPCR技術(shù)和酶活檢測(cè)實(shí)驗(yàn)手段檢測(cè)了RlDddP的蛋白酶功能。研究發(fā)現(xiàn)RldddP基因不能被短肽和酪蛋白誘導(dǎo),重組表達(dá)純化的RlDddP也檢測(cè)不到蛋白酶活性,說(shuō)明RlDddP從金屬蛋白酶進(jìn)化為DMSP裂解酶后完全喪失了蛋白酶功能。然后,我們分別對(duì)DddP的蛋白全長(zhǎng)及N端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生分析。研究發(fā)現(xiàn),DddP在M24金屬蛋白酶家族中形成了一個(gè)獨(dú)立的分支,而且擁有一個(gè)不同于其他M24金屬蛋白酶的全新的N端結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示全新的N端結(jié)構(gòu)域使得RlDddP形成了 一個(gè)緊密的二體結(jié)構(gòu),從而使得RlDddP的底物入口僅能允許DMSP進(jìn)入而不允許短肽進(jìn)入。接著,我們對(duì)RlDddP與M24金屬蛋白酶極為相似的C端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了結(jié)構(gòu)疊合分析。結(jié)果顯示在金屬蛋白酶中起穩(wěn)定反應(yīng)中間態(tài)作用的氨基酸突變成了DMSP裂解酶中的關(guān)鍵的催化堿。催化中心關(guān)鍵氨基酸的突變導(dǎo)致了RlDddP蛋白酶催化能力的喪失和DMSP裂解酶催化能力的形成。最后,在綜合N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,我們提出了 DddP從金屬蛋白酶進(jìn)化為DMSP裂解酶的機(jī)制。這一研究有助于更好地認(rèn)識(shí)DMSP裂解酶的進(jìn)化機(jī)制。3.海洋玫瑰桿菌類群細(xì)菌胞內(nèi)代謝丙烯酸的分子機(jī)制丙烯酸是重要的海洋微生物碳源,同時(shí)丙烯酸及其代謝產(chǎn)物丙烯酰輔酶A具有很高的細(xì)胞毒性,丙烯酸需要在胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速代謝從而避免對(duì)微生物的生存造成影響。但是到目前為止,丙烯酸代謝的分子機(jī)制尚不清楚。在本論文中,我們以代謝DMSP的主要類群海洋玫瑰桿菌類群細(xì)菌為研究對(duì)象,研究了 DMSP代謝菌株胞內(nèi)代謝丙烯酸的分子機(jī)制。首先,我們驗(yàn)證了該類群胞內(nèi)代謝丙烯酸的代謝途徑。研究發(fā)現(xiàn),該類群主要通過(guò)以丙酸輔酶A連接酶(PrpE)和烯酰輔酶A還原酶(AcuI)為關(guān)鍵酶的PrpE-AcuI途徑實(shí)現(xiàn)丙烯酸的代謝。然后,我們分別解析了Dinoroseobacter shibae DFL 12 的 PrpE 和 R.pomeeroyi DSS-3 的 AcuI的結(jié)構(gòu)。PrpE在溶液中以單體形式存在。它的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與同家族的其它�；o酶A連接酶相似,擁有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,一個(gè)N端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端結(jié)構(gòu)域。AcuI則在溶液中以二體形式存在。它的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與來(lái)自大腸桿菌的YhdH相似,擁有一個(gè)典型的rossmann折疊結(jié)構(gòu)用以結(jié)合輔酶NADPH。接著,我們分別研究了PrpE和AcuI催化中心保守的氨基酸的功能。PrpE具有兩個(gè)構(gòu)象,即腺苷酸形成構(gòu)象和硫酯形成構(gòu)象。PrpE高度保守的588位的賴氨酸和502位的甘氨酸分別位于兩個(gè)構(gòu)象的活性中心,且突變會(huì)導(dǎo)致PrpE的酶活喪失。因此,PrpE 588位的賴氨酸很可能是PrpE催化腺苷酸形成半反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸,而502位的甘氨酸則很可能是硫酯形成半反應(yīng)中的關(guān)鍵氨基酸。AcuI的催化中心結(jié)合一個(gè)NADPH輔基。NADPH煙酰胺基團(tuán)附近的親水氨基酸中僅有323位的精氨酸突變會(huì)顯著影響AcuI的酶活。因此,323位的精氨酸很可能是AcuI催化過(guò)程中接受電子的廣義酸,而NADPH則很可能在AcuI的催化過(guò)程中提供反應(yīng)的還原力。最后,綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們提出了 PrpE和AcuI共同參與胞內(nèi)代謝丙烯酸的分子機(jī)制。本研究對(duì)更好的認(rèn)識(shí)微生物的胞內(nèi)丙烯酸代謝具有重要意義。4.海洋玫瑰桿菌類群細(xì)菌分解DMSP的動(dòng)力學(xué)調(diào)控機(jī)制DMSP在細(xì)菌胞內(nèi)的分解代謝是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,涉及到多步反應(yīng),需要多種酶分工合作,相互協(xié)調(diào)。DMSP除了作為重要的硫循環(huán)和碳循環(huán)的載體物質(zhì)之外,還具有重要的生理功能。DMSP代謝菌株往往會(huì)在胞內(nèi)積累DMSP作為滲透壓保護(hù)劑、抗氧化劑或防凍劑。DMSP在胞內(nèi)的濃度可以達(dá)到毫摩爾量級(jí),而DMSP裂解過(guò)程的產(chǎn)物丙烯酸,尤其是丙烯酰輔酶A,具有很強(qiáng)的胞內(nèi)毒性,需要快速代謝。因此,DMSP分解代謝需要一個(gè)調(diào)控機(jī)制來(lái)維持胞內(nèi)的DMSP濃度并保證丙烯酸,尤其是丙烯酰輔酶A,的快速代謝。而到目前為止,尚沒(méi)有文獻(xiàn)涉及DMSP分解代謝的調(diào)控。在本論文中,我們以代謝DMSP的主要類群海洋玫瑰桿菌類群細(xì)菌為研究對(duì)象,研究了 DMSP裂解過(guò)程的動(dòng)力學(xué)調(diào)控機(jī)制。首先,我們研究了已報(bào)道的多種DMSP裂解酶、丙烯酸代謝相關(guān)酶PrpE和AcuI的Km值。研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的胞內(nèi)DMSP裂解酶的Km值PrpE的Km值A(chǔ)cuI的Km值。而后,我們比較了多種DMSP裂解酶,丙烯酸代謝相關(guān)酶PrpE和AcuI的kcat/Km值。結(jié)果表明,絕大多數(shù)的DMSP裂解酶的kcat/KmPrpE的kcat/Km值A(chǔ)cuI的kcat/Km值。在此基礎(chǔ)上,我們提出了 DMSP裂解過(guò)程的動(dòng)力學(xué)調(diào)控機(jī)制,即DMSP裂解酶、PrpE和AcuI底物結(jié)合能力和催化效率的不同保證了DMSP的胞內(nèi)積累和其代謝產(chǎn)物丙烯酸,尤其是丙烯酰輔酶A的快速代謝。接著,我們通過(guò)研究PrpE和AcuI在自然界的豐度發(fā)現(xiàn)PrpE和AcuI不僅在海洋玫瑰桿菌類群細(xì)菌中存在,在不同生境不同生物域的生物中均有分布。而且,除DMSP分解代謝外,多種代謝——如DMSP去甲基化代謝、乳酸代謝、丙酸代謝、β-丙氨酸和葡萄糖代謝——都可以產(chǎn)生丙烯酸和丙烯酰輔酶A。因此,DMSP裂解過(guò)程的動(dòng)力學(xué)調(diào)控機(jī)制不僅對(duì)來(lái)自海洋的玫瑰桿菌類群細(xì)菌的DMSP分解代謝具有意義,同時(shí)具有擴(kuò)展到其它生境的其它生物的其它代謝過(guò)程中的潛力,具有較為廣泛的意義。本論文對(duì)海洋玫瑰桿菌類群DMSP裂解酶裂解DMSP的分子機(jī)制、DMSP裂解酶的進(jìn)化機(jī)制、DMSP裂解產(chǎn)物丙烯酸胞內(nèi)代謝的分子機(jī)制及DMS分解代謝的動(dòng)力學(xué)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了較為深入的研究,研究結(jié)果有助于我們更好的認(rèn)識(shí)DMSP的分解代謝過(guò)程,更好的認(rèn)識(shí)地球硫循環(huán)和碳循環(huán)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q93

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本文編號(hào)：2391057