【摘要】：糖基化是生物體內(nèi)重要的翻譯后修飾之一。聚糖主要位于細(xì)胞與細(xì)胞之間,許多功能重要的蛋白,例如,酶,免疫受體和細(xì)胞生長因子受體都被糖基化修飾。越來越多的證據(jù)表明糖基結(jié)構(gòu)與其修飾的蛋白一起在細(xì)胞生長與發(fā)育,腫瘤轉(zhuǎn)移,免疫識別,細(xì)胞通訊和微生物入侵等過程發(fā)揮極其重要的作用。由于存在不同異頭分支和連接形式,糖基化的結(jié)構(gòu)多樣性可能超過線性的核酸和蛋白質(zhì)。糖基化結(jié)構(gòu)多樣性源于其非模板化的合成方式,不同的糖基轉(zhuǎn)移酶之間的競爭深刻影響聚糖結(jié)構(gòu)組成和表達(dá)的豐度。因而,準(zhǔn)確鑒定糖基化組成,相對豐度和位點面臨許多技術(shù)挑戰(zhàn)。本文利用基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜(MALDI-MS)對固定化衍生的唾液酸N-連接聚糖及其同分異構(gòu)體進(jìn)行鑒定和相對定量,以期找到與疾病相關(guān)的生物標(biāo)記物。同時探索通過酶化學(xué)和固定化方式對糖肽進(jìn)行富集。MALDI-MS是N-連接聚糖結(jié)構(gòu)鑒定重要技術(shù)平臺。然而,N-連接聚糖的唾液酸在質(zhì)譜檢測過程中容易發(fā)生源內(nèi)和源后裂解,影響質(zhì)譜對聚糖的鑒定。文獻(xiàn)報道甲胺化可以同時將α(2,3)和α(2,6)連接的唾液酸完全衍生。本文利用新型固定甲胺化衍生方式對N-連接聚糖末端的唾液酸進(jìn)行衍生。首先將糖蛋白通過還原胺化固定到瓊脂糖介質(zhì)上,然后在固相條件下對唾液酸進(jìn)行甲胺化衍生。結(jié)果表明,固相甲胺化能夠?qū)ν僖核嵬耆苌?同時減少樣品損失和污染。標(biāo)準(zhǔn)蛋白胎球蛋白在MALDI每個點的樣品量最低0.5μg。與傳統(tǒng)溶液中甲胺化相比較,固相甲胺化方法提高了檢測的靈敏度和信噪比。應(yīng)用該方法分析正常人血清和骨髓瘤患者的聚糖譜圖,觀測到在高分子量區(qū)段帶巖藻糖聚糖表達(dá)量的顯著差異。同時通過HPLC-熒光檢測驗證該方法在鑒定血清標(biāo)志物的潛力。在固定甲胺化衍生的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步發(fā)展為一種固定化兩步衍生方式實現(xiàn)唾液酸聚糖同分異構(gòu)體的鑒定。將蛋白固定到瓊脂糖介質(zhì)后,通過兩步衍生反應(yīng)使α(2,6)連接的唾液酸被乙酯衍生,而α(2,3)連接的唾液酸被甲胺衍生。乙酯化衍生使唾液酸分子量增加28 Da,甲胺化衍生使唾液酸分子量增加13 Da,通過兩者15 Da的分子量差異分辨聚糖唾液酸的連接方式。固定化兩步衍生方法克服了以往衍生方法形成的α(2,3)內(nèi)酯不穩(wěn)定的問題,提高了檢測重復(fù)性。固相兩步衍生方法應(yīng)用到單克隆抗體藥唾液酸聚糖的分析時,發(fā)現(xiàn)單克隆抗體藥的唾液酸全部為α(2,3)連接。最終,我們將固定兩步衍生用于肝癌血清標(biāo)志物的分析,通過受試者工作曲線分析鑒定6種與聚糖整體豐度相關(guān)和2種唾液酸同分異構(gòu)體相關(guān)的標(biāo)志物。相對于PNGase F,內(nèi)切糖苷酶ENDO-H可以研究高甘露糖型和雜合型聚糖。本文利用內(nèi)切糖苷酶ENDO-H對RNAse B和Avidin的N-聚糖進(jìn)行鑒定。同時在ENDO-H酶切過程中,糖肽上保留一個乙酰葡糖胺殘基。利用糖肽上保留的乙酰葡萄糖胺殘基,通過酶化學(xué)法和固定化方法對糖肽進(jìn)行富集。由于富集到的糖肽帶有一個特征性二糖標(biāo)簽,增加了糖肽鑒定的可信度。最終該方法可以同時鑒定蛋白的聚糖結(jié)構(gòu)和糖基化位點。本文在固相條件下實現(xiàn)了對唾液酸的衍生和唾液酸同分異構(gòu)體的鑒定。由于生成的衍生產(chǎn)物較為穩(wěn)定,實現(xiàn)對唾液酸聚糖同分異構(gòu)體的準(zhǔn)確相對定量。利用內(nèi)切糖苷酶ENDO-H實現(xiàn)了對聚糖結(jié)構(gòu)和糖基化位點初步研究。對單克隆抗體藥和肝癌樣品的分析顯示了在生物制藥工業(yè)和聚糖標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)方面廣闊的應(yīng)用前景。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q503

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1 李恒輝;N-聚糖質(zhì)譜檢測新方法研究及應(yīng)用[D];華中科技大學(xué);2016年

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本文編號：2379445