【摘要】：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一個(gè)保守的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶,在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)主要以：nTOR復(fù)合體1 (mTORC1)和mTOR復(fù)合體2(mTORC2)的形式存在,其中mTORC1的活性可以被Rapamycin抑制。mTORC1通路在調(diào)控細(xì)胞生長和增殖方面發(fā)揮極為重要的作用。盡管目前已經(jīng)證實(shí)mTORC1通路在多種人類疾病中處于異�；罨臓顟B(tài),比如腫瘤、糖尿病、肥胖和神經(jīng)退行性疾病等,但是nTORC1通路異常導(dǎo)致人類疾病的分子機(jī)制仍然不清楚。調(diào)控基因表達(dá)是mTORC1的一個(gè)重要功能,mTORC1不僅可以在轉(zhuǎn)錄水平還可以在翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)。然而,到底哪些蛋白受到mTORC1的表達(dá)調(diào)控,它們在mTORC1的下游發(fā)揮怎樣的功能,仍然有待進(jìn)一步的研究。因此,鑒定mTORC1調(diào)控蛋白對于研究mTORC1下游功能具有重要的意義。本研究采用iTRAQ技術(shù)對WT MEFs、TSC2-/-MEFs、和Rapamycin處理的TSC2-/ MEFs的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了定量分析,最終鑒定到了58個(gè)mTORC1調(diào)控蛋白。它們主要參與細(xì)胞骨架組裝、線粒體功能、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)核輸入通路、糖酵解通路、脂肪代謝和細(xì)胞周期等。首次發(fā)現(xiàn)mTORC1活化可以正調(diào)控多個(gè)蛋白質(zhì)核輸入通路中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的豐度,包括KPNA2、RanGAP1、RanBP2、NUP93和NUP107。我們采用免疫印跡方法對KPNA2、RanGAP1和RanBP2進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證,結(jié)果表明在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中mTORC1活化正調(diào)控這三個(gè)蛋白的豐度,這與質(zhì)譜結(jié)果一致。mTORC1對KPNA2的正調(diào)控還在其它多種小鼠和人類細(xì)胞中得到驗(yàn)證,表明這種調(diào)控廣泛存在。接著我們對mTORC1調(diào)控KPNA2的分子機(jī)制進(jìn)行了探索。結(jié)果顯示,mTORC1的兩個(gè)參與翻譯調(diào)控的經(jīng)典底物S6K1和4E-BP1均不參與mTORC1對KPNA2的調(diào)控；反而mTORC1活化正調(diào)控KPNA2 mRNA豐度。這些結(jié)果表明,mTORC1對KPNA2的表達(dá)調(diào)控是在轉(zhuǎn)錄水平,而不是在S6K1和4E-BP1依賴的翻譯水平。在本研究的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中鑒定到了9個(gè)糖酵解通路中的酶,它們的豐度在mTORC1活化時(shí)全部顯著增加(p0.05),在mTORC1的活性受到抑制時(shí)全部顯著降低(p0.05)。采用Real-time PCR方法,我們進(jìn)一步證實(shí)了mTORC1活化確實(shí)可以正調(diào)控糖酵解基因的表達(dá)。前人的研究表明KPNA2可以參與對糖酵解基因的表達(dá)調(diào)控。因此,我們推測KPNA2很可能參與了mTORC1對糖酵解基因的表達(dá)調(diào)控。在mTORC1活化的TSC2-/-MEFs中,敲低KPNA2顯著降低了糖酵解基因的mRNA豐度,這說明KPNA2確實(shí)參與了mTORC1對糖酵解基因的表達(dá)調(diào)控。由于KPNA2可以特異地識別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子HIF1α的核輸入標(biāo)簽(NLS), HIF1α也可以參與mTORC1對糖酵解基因的表達(dá)調(diào)控,我們進(jìn)一步考察了KPNA2是否是通過影響HIFlα的豐度或者亞細(xì)胞定位進(jìn)而參與對糖酵解基因的調(diào)控。首先證實(shí)了mTORC1通過HIF1α調(diào)控糖酵解基因的表達(dá),因?yàn)閙TORC1活化上調(diào)HIF1α的豐度,而敲低HIF1α則可以抑制nTORC1誘導(dǎo)的糖酵解基因的表達(dá)。然而,敲低KPNA2卻對HIF1α的豐度或者亞細(xì)胞定位均沒有影響,這表明KPNA2是通過一個(gè)不依賴HIF1α的方式參與mTORC1對糖酵解基因的表達(dá)調(diào)控的。進(jìn)一步的研究表明,HIF1α也不影響KPNA2的蛋白豐度,因?yàn)榍玫虷IF1α不影響KPNA2的蛋白豐度。上述結(jié)果表明,mTORC1通過HIFlα和KPNA2調(diào)控糖酵解基因的表達(dá)是兩條平行的、互不影響的通路�？偠灾�,本研究采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法,分析了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中mTORC1調(diào)控的蛋白譜,發(fā)現(xiàn)多個(gè)蛋白核輸入通路和糖酵解通路中的蛋白／酶受到mTORC1的調(diào)控；結(jié)合多種分子生物學(xué)方法,首次發(fā)現(xiàn)mTORC1正調(diào)控核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KPNA2的表達(dá),并且證明了其在mTORC1調(diào)控糖酵解基因中發(fā)揮重要作用。本研究為探索nTORC1下游功能以及研究mTORC1對糖酵解通路的調(diào)控機(jī)制提供了重要的參考和研究視角。
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【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院北京基因組研究所
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q51
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本文編號：2378387