【摘要】：與哺乳類動物和鳥類的胚胎發(fā)育不同,硬骨魚類基本上是體外受精體外發(fā)育,其肝臟發(fā)育過程中會遇到內(nèi)在或外在壓力,因此需要啟動一些機(jī)制消除或者中和外界壓力誘導(dǎo)的有害物質(zhì),使得胚胎發(fā)育處在最佳的外界環(huán)境中。但是當(dāng)環(huán)境壓力太大,體內(nèi)機(jī)制不足以保護(hù)正常的胚胎發(fā)育時,就會導(dǎo)致細(xì)胞周期受阻、細(xì)胞死亡或者衰老。因此,在長久進(jìn)化過程中,硬骨魚類需要一套完善的抗壓保護(hù)機(jī)制來保護(hù)胚胎發(fā)生和器官形成。而這種抵抗外界環(huán)境的機(jī)制或者方式是發(fā)育生物學(xué)有志探究卻又知之甚少的領(lǐng)域。legl (liver enriched gene 1,肝臟富集基因1)是一個功能未知的基因。leg1在斑馬魚基因組中存在legla和leglb兩個拷貝,序列比對發(fā)現(xiàn)leg1a和leglb兩個基因,結(jié)構(gòu)相近、序列相似、串聯(lián)定位在第20號染色體上。兩個基因都編碼著一條361個氨基酸多肽,兩條多肽高度相似,一致性達(dá)90.6%。leg1編碼一種新型的分泌蛋白,該蛋白包含一個功能未知的結(jié)構(gòu)域DUF781 (domain of unknown function 781),序列分析發(fā)現(xiàn)該蛋白在脊椎動物中是保守的。我們采用TALEN技術(shù)獲得了兩個legla突變體品系,即leglzju1和leglzju2。通過整胚原位雜交方法我們觀察了兩個突變體中肝臟發(fā)育情況,發(fā)現(xiàn)legla母源-合子型突變體僅在壓力條件下(如高密度高溫或UV照射或H2O2處理)表現(xiàn)出小肝臟表型。由于在UV照射或H2O2處理條件下同時添加抑制ROS產(chǎn)生的化合物APO和DPI能挽救以上壓力條件下legla母源-合子型突變體的小肝臟表型,說明這些壓力條件下ROS的過量產(chǎn)生是導(dǎo)致小肝臟表型的原因。用肝臟早期發(fā)育的分子標(biāo)記如foax3, gata6, prox1以及hhex做整胚原位雜交顯示,在壓力條件下Legla的缺失導(dǎo)致了肝臟細(xì)胞周期嚴(yán)重阻滯,從而使得肝芽的形成受到了影響,并最終致使leglazjul母源-合子型突變體的肝臟明顯小于野生型的。有趣的是我們發(fā)現(xiàn)Legla的缺失對其它消化器官的發(fā)育影響不明顯,僅外分泌胰腺發(fā)育受到些微抑制。在Legla作用機(jī)理研究方面,我們通過legla mRNA注射到魚卵發(fā)現(xiàn)在壓力條件下Legla促進(jìn)Erk的磷酸化,通過將表達(dá)Legla的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的人細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Legla可能與FGFR3相互作用。此外,我們發(fā)現(xiàn),壓力條件下,Legla第70位天冬酰胺(N70)糖苷化修飾突變?yōu)楸彼岷蟛荒芗せ頔rk信號通路,不能保護(hù)肝臟發(fā)育,同時N70連接的糖苷化修飾對于Legla與FGFR3相互作用非常重要。綜上所述,本課題研究發(fā)現(xiàn),Legl作為一個分泌到細(xì)胞外的新型信號因子,通過激活Erk信號通路形成了一種新的抵抗壓力的信號通路來保護(hù)肝臟發(fā)育。該研究結(jié)果及進(jìn)一步的深入研究有望揭示硬骨魚類適應(yīng)環(huán)境改變的原因。
[Abstract]:Unlike the embryonic development of mammals and birds, bony fish are basically developed in vitro during in vitro fertilization, and their liver is subject to internal or external pressure during development. So it is necessary to activate some mechanisms to eliminate or neutralize harmful substances induced by external pressure, so that embryo development is in the best external environment. But when the environment is too stressful to protect normal embryonic development, it can lead to cell cycle arrest, cell death or aging. Therefore, in the long evolution process, bone-fish need a set of perfect pressure protection mechanism to protect embryogenesis and organogenesis. And the mechanism or way to resist the outside environment is. Legl (liver enriched gene 1, a field that developmental biology wants to explore but knows little about. There are two copies of legla and leglb in the genome of zebrafish leg1. Two genes, leg1a and leglb, are found to be similar in structure and sequence by sequence alignment, and they are located on chromosome 20 in tandem. Both genes encode a 361 amino acid polypeptide, and the two peptides are highly similar. The consensus 90.6%.leg1 encodes a novel secretory protein containing an unknown domain, DUF781 (domain of unknown function 781). Sequence analysis showed that the protein was conserved in vertebrates. Two legla mutants, leglzju1 and leglzju2., were obtained by using TALEN technique. The development of liver in two mutants was observed by in situ hybridization. It was found that legla mother-zygote mutants showed small liver phenotype only under high pressure (such as high density high temperature or UV irradiation or H2O2 treatment). The small liver phenotype of legla mother-zygote mutant could be saved under the condition of UV irradiation or H2O2 treatment by adding the compounds APO and DPI to inhibit the production of ROS. It is suggested that excessive production of ROS under these stress conditions is responsible for the phenotype of small liver. In situ hybridization using molecular markers such as foax3, gata6, prox1 and hhex for early liver development showed that the absence of Legla under pressure resulted in a severe arrest of liver cell cycle, which affected the formation of liver buds. Finally, the liver of leglazjul mother-zygote mutant was significantly smaller than that of wild-type mutant. Interestingly, we found that the absence of Legla had little effect on the development of other digestive organs, with only a slight inhibition on the development of exocrine pancreas. In the study of the mechanism of Legla, we found that Legla promoted the phosphorylation of Erk under pressure by injecting legla mRNA into fish eggs, and that Legla might interact with FGFR3 by transfecting the plasmid expressing Legla into cultured human cells. In addition, we found that Legla 70th position asparagine (N70) glycosylation mutated to alanine could not activate Erk signaling pathway and protect liver development under pressure. At the same time, the glycosylation modification of N 70 junctions is very important for the interaction between Legla and FGFR3. In conclusion, we found that Legl, as a novel extracellular signal factor, protects liver development by activating the Erk signaling pathway to form a new stress-resistant signaling pathway. The results and further studies are expected to reveal the reasons for the adaptation of bony fish to the environment.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q954.4

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本文編號：2344828