【摘要】：耐輻射奇球菌作為迄今為止發(fā)現(xiàn)的輻射抗性最強(qiáng)的物種之一,由于對電離輻射,紫外輻射,干燥,雙氧水及其他一系列DNA損傷試劑都顯示出極強(qiáng)的抗性,而被科學(xué)界廣泛地用作研究DNA損傷修復(fù)及極端抗性研究的理想模式生物。在耐輻射奇球菌的基因組中有許多編碼轉(zhuǎn)錄因子的開放閱讀框存在,然而許多轉(zhuǎn)錄因子的具體功能,活性以及結(jié)合調(diào)控的位點都還沒有得到闡述。環(huán)腺苷受體蛋白(Cyclic AMP receptor protein,CRP)作為廣泛存在于各種細(xì)菌內(nèi)的全局調(diào)控因子,在應(yīng)對不同環(huán)境壓力過程中調(diào)控著細(xì)胞內(nèi)多種代謝通路。然而至今還未有報道直接提出轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CRP與細(xì)胞的輻射抗性之間的聯(lián)系。經(jīng)同源比對發(fā)現(xiàn)耐輻射奇球菌中編碼了四個crp同源基因,包括dr0997,dr2362, dr0834和dr1646。近年來有研究在經(jīng)過電離輻射處理后,其中一個crp同源基因dr0997的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了38倍,進(jìn)而被命名為ddrI。我們通過檢測雙氧水處理前后crp各基因的轉(zhuǎn)錄水平,也發(fā)現(xiàn)dr0997的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了4倍多,而其他兩個crp同源基因也上調(diào)了近2倍,這些結(jié)果證實CRP參與了耐輻射奇球菌的抗輻射及抗氧化進(jìn)程。本文圍繞著CRP在抗輻射及抗氧化方面的功能展開研究,主要內(nèi)容和研究成果如下：1.通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)耐輻射奇球菌中編碼CRP的4個同源基因,經(jīng)序列比對分析,發(fā)現(xiàn)該類蛋白與經(jīng)典大腸桿菌CRP蛋白具有相似的cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,并發(fā)現(xiàn)多個參與信號分子及DNA結(jié)合的保守氨基酸位點。2.通過對四個crp同源基因進(jìn)行原位突變,結(jié)果表明：dr0997對細(xì)胞生長,氧化抗性和輻射抗性都非常重要；dr2362只對細(xì)胞氧化抗性有貢獻(xiàn)；dr0834和dr1646對細(xì)胞生長和輻射抗性貢獻(xiàn)都不大。3.通過實時定量PCR檢測dr0997突變株與野生株在雙氧水處理前后過氧化氫酶和超氧化物歧化酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)突變株許多基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)；通過檢測野生型與突變株輻照前后各種修復(fù)基因的轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)dr0997突變株中各種與修復(fù)密切相關(guān)的基因,包括recA,recG,priA等轉(zhuǎn)錄水平都有大幅度的下調(diào),其他如ddrO, drRRA, ddrB, ddrC, ddrD,recF, recO等等均有不同程度的下調(diào)。4.通過尋找CRP結(jié)合位點及凝膠遷移率實驗驗證,發(fā)現(xiàn)了18個受DR0997直接調(diào)控的基因,包括三個修復(fù)相關(guān)基因recN(dr1447), pprA (dra0346)和uvsE (dr1819);兩個與抗氧化機(jī)制相關(guān)的基因nuoA(dr1506)和terB(dr2220);以及一系列與細(xì)胞生理活性相關(guān)的基因,包括糖類代謝相關(guān)基因glpF (dr1929)和glgC(dr1689),與蛋白損傷代謝相關(guān)的兩個Lon蛋白酶編碼基因(dr1974和dr0349);與cAMP代謝相關(guān)性基因drA0006與cpdB (dra0006)等等。同時還發(fā)現(xiàn)DR0997具有自我調(diào)控的能力。5.經(jīng)凝膠遷移率實驗及β-半乳糖苷酶實驗證實DR0997直接調(diào)控一系列碲抗性蛋白的編碼基因,包括terE(dr2217),terB(dr2220),terD1(dr2221), terA(dr2223), terZ(dr2224)和terC(dr2226)。通過構(gòu)建各碲耐受性基因的突變株,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TerE,TerB,TerD與TerC對細(xì)胞氧化抗性有貢獻(xiàn)。綜上所述,CRP同源物DR0997對耐輻射奇球菌的極端抗性非常重要,作為一個具有特異性DNA結(jié)合活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,通過直接和間接調(diào)控的方式影響著細(xì)胞內(nèi)修復(fù)相關(guān)的基因的表達(dá),該蛋白的全局性調(diào)控影響還在探索之中。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
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本文編號：2342241