本文關(guān)鍵詞：RACK1蛋白對(duì)IBDV VP5蛋白與宿主VDAC2蛋白相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)

2015年；博士論文

藺文成； 鄭世軍；

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease virus, IBDV)引起的一種急性、高度傳染性的免疫抑制性疾病。IBDV感染的靶器官是雞的法氏囊,感染后會(huì)誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡,造成法氏囊組織的損傷。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)IBDV的非結(jié)構(gòu)蛋白VP5通過(guò)與電壓依賴性陰離子通道2(Voltage-dependent anion channel2, VDAC2)相互作用引起雞成纖維細(xì)胞(DF-1)的凋亡并促進(jìn)病毒的釋放,但其內(nèi)在機(jī)制并不清楚。本研究利用酵母雙雜交、免疫共沉淀和激光共聚焦顯微鏡等實(shí)驗(yàn)方法尋找VP5與VDAC2相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)分子,解析IBDV VP5誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程,為揭示IBDV引起細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理提供依據(jù)。 本研究以VDAC2作為“誘餌”蛋白,利用酵母雙雜交方法在雞法氏囊組織cDNA文庫(kù)中篩選到與VDAC2相互作用的靶蛋白：激活的蛋白激酶C1受體(Receptor for activated protein C-kinase1, RACK1)。通過(guò)β半乳糖營(yíng)酶活性分析驗(yàn)證了二者在酵母內(nèi)的相互作用；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RACK1能與VDAC2和VP5發(fā)生相互作用,RACK1和VDAC2分別特異性地結(jié)合在VP5的兩端,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)RACK1、VDAC2和IBDV VP5蛋白能在細(xì)胞內(nèi)形成復(fù)合物；激光共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)證實(shí)RACK1能與VDAC2和IBDVVP5共定位于線粒體上。 隨后研究發(fā)現(xiàn),在DF-1細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞(Primary chicken embryo fibroblast, CEF)中過(guò)表達(dá)RACK1蛋白能顯著抑制IBDV感染引起的細(xì)胞凋亡,在DF-1細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)RACK1蛋白能顯著促進(jìn)細(xì)胞沉淀中IBDV的增殖,在細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒載量沒(méi)有發(fā)生明顯變化,而在CEF細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RACK1蛋白,無(wú)論是上清還是沉淀,病毒的載量都顯著提高,表明過(guò)表達(dá)RACK1蛋白能促進(jìn)IBDV的增殖。利用RNAi方法沉默DF-1細(xì)胞中內(nèi)源性RACK1蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)RACK1蛋白沉默表達(dá)的細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象并顯著抑制了病毒的增殖,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)RACK1蛋白沉默表達(dá)誘導(dǎo)的凋亡與Caspase-3和Caspase-9的活化有關(guān)。 綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)RACK1、VDAC2和IBDV VP5能在病毒感染細(xì)胞內(nèi)形成復(fù)合物,RACK1能抑制IBDV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生,促進(jìn)病毒的增殖,在IBDV感染過(guò)程中發(fā)揮抑制凋亡的作用,為深入了解IBDV的致病機(jī)制提供了重要參考依據(jù)。

  本文關(guān)鍵詞：RACK1蛋白對(duì)IBDV VP5蛋白與宿主VDAC2蛋白相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。