發(fā)布時(shí)間：2018-10-24 16:12

【摘要】：植物根尖干細(xì)胞微環(huán)境對于植物根的生長發(fā)育具有重要作用,其中根尖干細(xì)胞是產(chǎn)生根中不同組織細(xì)胞的源泉,而位于干細(xì)胞中間的靜止中心(Quiescent Center, QC)細(xì)胞對于干細(xì)胞活性的維持具有十分重要的調(diào)控作用。目前研究發(fā)現(xiàn)的參與根尖干細(xì)胞微環(huán)境維持的調(diào)控途徑主要包括SCR/SHR調(diào)控途徑、PLT調(diào)控途徑、WOX5調(diào)控途徑、各種激素(生長素、細(xì)胞分裂素、乙烯、脫落酸以及赤霉素等)參與的調(diào)控途徑。然而,參與根尖干細(xì)胞微環(huán)境維持的其它調(diào)控因子目前仍不清楚。因此,我們的研究致力于發(fā)現(xiàn)新的參與維持根尖干細(xì)胞微環(huán)境的調(diào)控元件,這對于進(jìn)一步闡明根尖干細(xì)胞微環(huán)境維持的調(diào)控機(jī)制網(wǎng)絡(luò)具有十分深遠(yuǎn)的意義。本研究以模式植物擬南芥為研究對象,通過Lugol染色,從T-DNA插入突變體庫中特異的篩選具有根尖干細(xì)胞發(fā)育缺陷表型的突變體材料,進(jìn)行后續(xù)研究。在此,通過篩選我們獲得了一個(gè)新的參與根尖干細(xì)胞微環(huán)境維持的功能基因APP1 (A-P-loop NTPase superfamily Protein)。采用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)及生理學(xué)等技術(shù)方法,對APP1參與調(diào)控根尖干細(xì)胞微環(huán)境維持的分子機(jī)制進(jìn)行了深入的研究分析。Lugol染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn),app1功能缺失突變體根尖QC細(xì)胞發(fā)生了明顯的縱向分裂,并且遠(yuǎn)端干細(xì)胞(Distal stem cell, DSC)處出現(xiàn)了明顯的能夠被KI染色的淀粉粒積累,表明失去了干細(xì)胞活性。此外,QC特異標(biāo)記基因QC184在app1突變體中的表達(dá)量明顯低于野生型,這表明app1突變體中QC的特性受到了破壞。為了闡明其作用機(jī)理,我們進(jìn)一步檢測APP1表達(dá)模式及其編碼蛋白的亞細(xì)胞定位。對pAPP1::GUS轉(zhuǎn)基因系的GUS染色結(jié)果表明,APP1主要在擬南芥的根中表達(dá),而且主要集中在根尖處；此外,激光共聚焦觀察pAPP1:.APP1-GFP轉(zhuǎn)基因株系的結(jié)果發(fā)現(xiàn),APP1蛋白也是主要在根尖處表達(dá),暗示APP1可能參與根尖生長發(fā)育的調(diào)控。激光共聚焦觀察結(jié)果顯示,pAPP1::APP1-GFP綠色熒光蛋白和紅色熒光MT-Red標(biāo)記的線粒體能夠重疊,說明APP1蛋白定位于線粒體;另一方面,western blot結(jié)果顯示,在pAPPl::APP1-GFP轉(zhuǎn)基因植株的線粒體蛋白中能夠同時(shí)檢測到APP1蛋白和線粒體特異標(biāo)記COX IV蛋白,進(jìn)一步說明APP1蛋白定位于線粒體。這也暗示APP1可能通過影響線粒體的功能參與根尖干細(xì)胞微環(huán)境的維持。體外ATP酶活測定結(jié)果說明,APP1具有ATP水解酶活性。為了闡明線粒體定位且具有ATP水解酶活性的APP1是否影響ROS穩(wěn)態(tài)的維持。我們通過熒光染料H2DCFDA和化學(xué)染料DAB以及NBT檢測app1突變體中ROS的水平。結(jié)果顯示,在app1中的熒光強(qiáng)度或化學(xué)染色水平要明顯低于野生型,表明app1中的ROS水平顯著降低;此外,與野生型相比,app1突變體中線粒體O2-的標(biāo)記rnarker Mito-cpYFP也明顯低于野生型對照。并且H202含量的測定結(jié)果顯示app1-1和app1-2突變體中H202的含量明顯低于Col-0對照。這些結(jié)果說明APP1能影響根尖ROS的含量,包括H202含量和O2-含量。進(jìn)一步分析APP1影響根尖ROS水平的機(jī)制,我們發(fā)現(xiàn)在app1突變體中第1II類過氧化物酶(Peroxidases, PER)家族中的PER11和PER55基因的表達(dá)受到明顯誘導(dǎo),說明app1突變體中較低的ROS水平可能與高表達(dá)的過氧化物酶PER11和PER55參與ROS的清除有關(guān)。此外,app1突變體中線粒體復(fù)合體I的活性,即NADH-CoQ還原酶的活性與野生型相比明顯降低,這與app1突變體中ROS水平低是相一致的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證app1突變體中QC細(xì)胞分裂和DSC分化的加快是否是由于app1突變體中較低的ROS水平引起的,我們對app1突變體進(jìn)行外源施加H202及02-的供體。結(jié)果顯示,無論是通過MV處理升高02-的水平,還是通過直接外源施加H2O2,都能夠恢復(fù)app1突變體中QC細(xì)胞分裂和DSC分化加快的表型。此外,通過外源施加ROS的合成抑制劑DPI和清除劑catalase降低ROS的水平,則能夠模擬app1突變體中的低ROS水平導(dǎo)致的QC細(xì)胞分裂和DSC分化的表型,破壞根尖干細(xì)胞微環(huán)境功能的維持。為了深入了解ROS穩(wěn)態(tài)是如何影響根尖干細(xì)胞微環(huán)境的,我們對高ROS水平下QC細(xì)胞和根尖DSC細(xì)胞的表型進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn)高濃度的H202也會(huì)促進(jìn)QC細(xì)胞的分裂以及DSC的分化；此外,APP1的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系35S：.APP1中ROS含量明顯升高,并且表現(xiàn)出較高的QC分化率和DSC分化率的表型。以上結(jié)果說明,無論是內(nèi)源升高ROS水平還是外源升高ROS水平都會(huì)加速Q(mào)C細(xì)胞的分裂和DSC的分化,對根尖干細(xì)胞功能造成一定程度的破壞。GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族的SCR(SCARECROW)和 SHR(SHORTROOT)以及PLETHORA轉(zhuǎn)錄因子家族的PLT1和PLT2對于維持QC細(xì)胞的功能、干細(xì)胞的穩(wěn)定具有重要的調(diào)控作用。為了研究APP1參與調(diào)控根尖干細(xì)胞的機(jī)制,我們對app1中SCR、SHR、PLT1以及PLT2的表達(dá)量進(jìn)行了檢測。qRT-PCR、細(xì)胞生物學(xué)以及western blot的結(jié)果均顯示app1變變體根尖中SCR和SHR在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)量都明顯降低,而PLT1和PLT2的表達(dá)量無明顯變化,暗示SCR和SHR可能作為APP1的下游基因共同參與APP1對于根尖干細(xì)胞微環(huán)境維持的調(diào)控。已有的研究表明,生長素參與根尖干細(xì)胞微環(huán)境的維持。我們發(fā)現(xiàn)DR5rev::GFP和DR5::GUS在app1-1和app1-2突變體中的表達(dá)量與野生型Col-0中相比無明顯變化,說明app1突變體中生長素信號沒有發(fā)生明顯改變,暗示APP1對于根尖干細(xì)胞微環(huán)境的調(diào)控機(jī)制可能是獨(dú)立于生長素調(diào)控途徑的。進(jìn)一步研究ROS穩(wěn)態(tài)參與根尖干細(xì)胞微環(huán)境維持的分子機(jī)制,我們分析了不同ROS濃度下調(diào)控干細(xì)胞功能的轉(zhuǎn)錄因子SCR、SHR、PLT1以及PLT2表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示,在高ROS濃度時(shí),PLT1和PLT2的表達(dá)量受到明顯下調(diào),而SCR和SHR的表達(dá)量沒有明顯變化；而在低ROS濃度時(shí),SCR和SHR的表達(dá)量明顯降低,PLT1和PLT2的表達(dá)量無顯著變化,這與app1突變體中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況是相一致的。這暗示高ROS水平和低ROS水平對于根尖干細(xì)胞微環(huán)境的調(diào)控可能是通過調(diào)控不同轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),通過不同的信號通路實(shí)現(xiàn)的。綜上所述,我們的研究發(fā)現(xiàn)APP1主要是通過影響根中ROS穩(wěn)態(tài)的維持,從而下調(diào)SCR和SHR的表達(dá),參與根尖干細(xì)胞微環(huán)境的維持。此外,我們還發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)存在一個(gè)最適的ROS濃度,維持根尖干細(xì)胞的正常功能,過高的ROS水平或過低的低ROS水平都可能導(dǎo)致根尖干細(xì)胞微環(huán)境的破壞。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q945

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Qi-Na Huang;Yong-Feng Shi;Xiao-Bo Zhang;Li-Xin Song;Bao-Hua Feng;Hui-Mei Wang;Xia Xu;Xiao-Hong Li;Dan Guo;Jian-Li Wu;;Single base substitution in Os CDC48 is responsible for premature senescence and death phenotype in rice[J];Journal of Integrative Plant Biology;2016年01期

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本文編號：2291876