【摘要】：嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)是重要的工業(yè)菌株,作為發(fā)酵劑與保加利亞乳桿菌或瑞士乳桿菌一起應(yīng)用于酸奶或奶酪的生產(chǎn),賦予產(chǎn)品特殊的風(fēng)味、質(zhì)地和保質(zhì)期。發(fā)酵劑菌株的活力直接影響發(fā)酵乳的品質(zhì),但是容易受到酸、溫度、氧、滲透壓等因素的影響。因此,闡明菌株抗性機(jī)制,提高其抗脅迫能力,是制備高活性發(fā)酵劑的關(guān)鍵。嗜熱鏈球菌屬于兼性厭氧菌,在所有脅迫中,氧脅迫對(duì)其造成的傷害最為嚴(yán)重。研究發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌具有一定的抵抗活性氧的能力,可以在有氧條件下生長(zhǎng)和在低H2O2濃度下存活,但是該菌株缺少過(guò)氧化氫酶,其抵抗過(guò)氧化氫脅迫的機(jī)制一直未被闡明。本文主要圍繞S. thermophilus CGMCC7.179過(guò)氧化物酶的鑒定和作用展開(kāi)研究。首先對(duì)已測(cè)序的S. thermophilus CGMCC7.179進(jìn)行基因組序列分析,鑒定出了染料過(guò)氧化物酶及其相關(guān)基因,并檢測(cè)了這些基因是否具有抵抗氧脅迫的能力,進(jìn)一步研究了染料過(guò)氧化物酶消除過(guò)氧化氫的能力和作用方式；研究了染料過(guò)氧化物酶轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的功能,并探討了該系統(tǒng)在其它乳酸菌中的可利用性。取得的具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：1. S. thermophilus CGMCC7.179染料過(guò)氧化物酶efeB基因的遺傳組成和抗氧脅迫能力嗜熱鏈球菌具有超氧化物歧化酶,其催化產(chǎn)生的H2O2會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害。然而,嗜熱鏈球菌中H2O2的消除機(jī)制尚不清晰。本文在S. thermophilus CGMCC7.179的基因組中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)染料過(guò)氧化物酶家族的基因efeB,其編碼蛋白的氨基端攜帶一個(gè)具有雙精氨酸易位(twin-arginine translocation, Tat)保守基序的信號(hào)肽,而且此基因與Tat系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)元件基因tatA和tatC一起位于efeOBU-tatCA操縱子中。敲除fefB基因不影響S. thermophilus CGMCC7.179在靜置條件下的生長(zhǎng),但是會(huì)導(dǎo)致S.thermophilus CGMCC7.179在搖動(dòng)培養(yǎng)時(shí)的生物量和活菌數(shù)顯著下降,說(shuō)明EfeB具有抵抗氧脅迫的能力。tatC基因的敲除對(duì)S. thermophilus CGMCC7.179的影響類(lèi)似于efeB基因,而且,只有在tatC基因存在時(shí),回補(bǔ)efeB基因才能夠彌補(bǔ)S. thermophilusCGMCC7.179 efe B缺失株在搖動(dòng)培養(yǎng)時(shí)的生物量下降。說(shuō)明EfeB抗氧脅迫能力的實(shí)現(xiàn)需要Tat系統(tǒng)的協(xié)助。同時(shí),S. thermophilus CGMCC7.179中的氯霉素抗性實(shí)驗(yàn)和Escherichia coli DE3中的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了TatCA對(duì)EfeB的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。此外,RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí),在搖動(dòng)培養(yǎng)條件下,efeB和tatC基因的轉(zhuǎn)錄水平均得到了相似的上調(diào),進(jìn)一步表明這兩個(gè)基因?qū)儆谝粋�(gè)操縱子。以上結(jié)果表明S. thermophilus CGMCC7.179編碼的EfeB經(jīng)Tat系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外,以緩解細(xì)胞受到的氧化壓力的傷害。2.5. thermophilus CGMCC7.179 EfeB的功能研究血紅素過(guò)氧化物酶可以催化特定的電子供體還原過(guò)氧化氫為水,根據(jù)其作用和結(jié)構(gòu)特征,血紅素過(guò)氧化物酶可以分為動(dòng)物過(guò)氧化物酶、植物過(guò)氧化物酶家族和新劃分出的染料過(guò)氧化物酶家族。本文為了確定EfeB的功能,首先將其序列與多種染料過(guò)氧化物酶的序列進(jìn)行了比對(duì),發(fā)現(xiàn)EfeB具有染料過(guò)氧化物酶的保守結(jié)構(gòu)域G-X-X-D-G和heme結(jié)合位點(diǎn),并且與肉葡萄球菌編碼的染料過(guò)氧化物酶FepB的相似性高達(dá)48.13%,表明EfeB具有染料過(guò)氧化物酶的結(jié)構(gòu)特征。為了研究EfeB的酶學(xué)性質(zhì),我們?cè)诖竽c桿菌中表達(dá)純化了EfeB蛋白,該蛋白在200μM H2O2條件下可以使活性藍(lán)5褪色,表明EfeB具有過(guò)氧化物酶酶活,此反應(yīng)的最適pH和最適溫度分別為4.0和30℃,與嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)環(huán)境并不相符。為了檢測(cè)EfeB消除H202的能力,我們測(cè)定了S. thermophilus CGMCC7.179及其efeB缺失株的搖動(dòng)培養(yǎng)物中的H202濃度,結(jié)果顯示fefB缺失會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境中H202濃度的升高,表明EfeB具有消除生存環(huán)境中H2O2的能力。此外,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)S. thermophilus CGMCC7.179的efeB缺失株能夠利用三價(jià)鐵離子,但是缺少利用二價(jià)鐵離子的能力,而且對(duì)高濃度二價(jià)鐵離子的耐受能力降低,表明EfeB可以氧化二價(jià)鐵離子。由此可見(jiàn),S. thermophilus CGMCC7.179中的EfeB具有消除H2O2的作用,同時(shí)與二價(jià)鐵離子的攝取有關(guān),與efeOBU的基因結(jié)構(gòu)相吻合。3. S. thermophilus CGMCC7.179 Tat系統(tǒng)組分的功能研究Tat系統(tǒng)負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)折疊后的蛋白,在轉(zhuǎn)運(yùn)含輔基或多亞基蛋白方面具有優(yōu)勢(shì),但是這一系統(tǒng)在乳酸菌中非常罕見(jiàn)。我們?cè)赟. thermophilus CGMCC7.179中發(fā)現(xiàn)了Tat系統(tǒng)的TatA和TatC組分,但是它們的功能鮮為人知。本文中我們將tatA基因和tatC基因回補(bǔ)到E. coli DE3的tat缺失菌株中,構(gòu)建了回補(bǔ)菌株E. coli ArA, ArAB, CrC和 ACrAD用以檢測(cè)TatA和TatC組分的功能。E.coli DE3的tat缺失菌株對(duì)十二烷基磺酸鈉(SDS)敏感,而且細(xì)胞表現(xiàn)為鏈狀。在回補(bǔ)菌株中,E coli ArAB和CrC既表現(xiàn)出相對(duì)正常的細(xì)胞形態(tài),也能夠抵抗較高濃度的SDS。然而,E. coli ACrAD只有相對(duì)正常的細(xì)胞形態(tài),對(duì)SDS仍然極為敏感。與之相反,E. coli ArA能夠耐受SDS,卻表現(xiàn)出極為嚴(yán)重的細(xì)胞鏈化現(xiàn)象。這些結(jié)果表明,TatA和TatC在E. coli DE3的tat缺失菌株中都具有易位酶活性,可以幫助E coli DE3缺失株緩解細(xì)胞鏈化或者重建SDS抗性。而且TatA是一個(gè)雙功能組分,可以同時(shí)彌補(bǔ)TatAE和TatBE(下標(biāo)“E”表示此組分屬于大腸桿菌)；另一方面,TatA的作用效果會(huì)受到TatBE的影響。因此,S.. thermophilus CGMCC 7.179的TatA和TatC都具有Tat組分的典型功能,它們可以在大腸桿菌中組成一個(gè)最小化的Tat系統(tǒng)。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以推測(cè)出S.. thermophilus CGMCC7.179 efeOBU-tatCA操縱子的作用方式。TatC和TatA形成通道,將EfeB轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外；EfeB在胞外具有雙功能,一方面可以以蒽醌類(lèi)物質(zhì)為電子供體消除環(huán)境中的過(guò)氧化氫,另一方面將二價(jià)鐵離子氧化為三價(jià)鐵離子,再由EfeOU復(fù)合體攝取到胞內(nèi)。4. S. thermophilus CGMCC7.179 Tat系統(tǒng)在乳酸乳球菌中的利用乳酸菌作為食品級(jí)安全菌株,是優(yōu)秀的食品級(jí)重組蛋白生產(chǎn)菌株。為了提高重組蛋白的產(chǎn)量,研究者們正不斷豐富其表達(dá)和分泌系統(tǒng)。目前乳酸菌中使用的分泌系統(tǒng)以Sec系統(tǒng)為主,大多數(shù)乳酸菌不具有可以分泌折疊蛋白的Tat系統(tǒng)。本文從蛋白功能和蛋白亞細(xì)胞定位兩個(gè)方面探究S. thermophilus CGMCC7.179的Tat系統(tǒng)在Lactococcus lactis MG1363中的功能。由于Lc.lactis MG1363的抗氧化能力強(qiáng)于S.thermophilus CGMCC7.179,不受搖動(dòng)培養(yǎng)的影響,我們使用H2O2來(lái)檢測(cè)菌株的抗氧化能力。弱啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下低量串聯(lián)表達(dá)的EfeB和TatCA不能提高Lc. lactis MG1363的抗H202能力；強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下高量串聯(lián)表達(dá)EfeB和TatCA可以解除單獨(dú)高量表達(dá)EfeB造成的生長(zhǎng)速度減緩,而且增強(qiáng)了Lc. lactis MG1363的抗H202能力,表明TatCA可以轉(zhuǎn)運(yùn)EfeB,并發(fā)揮抗氧脅迫能力。為了直觀展示Lc. lactis MG1363中TatCA對(duì)底物蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn),我們分別將金黃色葡萄球菌核酸酶基因nuc和綠色熒光蛋白基因gfp與EfeB的信號(hào)肽序列sp融合后作為報(bào)告基因,與tatCA一起轉(zhuǎn)化到Lc. lactis MG1363中。結(jié)果表明,TatCA可以轉(zhuǎn)運(yùn)spNuc蛋白至胞外,但是轉(zhuǎn)運(yùn)spGFP的能力非常有限。所有結(jié)果表明,S. thermophilus CGMCC7.179的Tat系統(tǒng)在Lc.lactis MG1363中可以發(fā)揮作用,但是對(duì)于不同的底物蛋白有不同的效果。5. Lactobacillus fermentum 1001木糖利用脫阻遏機(jī)制研究發(fā)酵乳桿菌是一種生存環(huán)境較為復(fù)雜的乳酸菌,可以同時(shí)利用葡萄糖和木糖,缺失碳源代謝物抑制(CCR)。為了研究這一現(xiàn)象的原因,本文首先驗(yàn)證了Lact.fermentum 1001 CcpAf的生理功能。RT-PCR結(jié)果表明Lact.fermentum 1001中ccpAf基因的可以正常轉(zhuǎn)錄；Lc.lactis MG1363 ccpA缺失菌株的生長(zhǎng)會(huì)明顯滯后于野生菌株,回補(bǔ)ccpAf基因可以有效提高Lc. lacrtis MG1363 ccpA缺失菌株的生長(zhǎng)速度,此結(jié)果證明CcpAf具有正常的生理功能。為了探究是否是1,6-二磷酸果糖的缺失造成了Lact.fermentum 1001中CCR的缺失,我們?cè)贚act. fermentum 1001中表達(dá)了Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC11842的磷酸果糖激酶,重組菌的果糖的利用會(huì)受到葡萄糖的松散抑制,但是木糖的利用不受影響,表明CcpAf在 Lact. fermentum 1001中可以正常發(fā)揮作用,1,6-二磷酸果糖的缺失是Lact. fermentum 1001中CCR缺失的一個(gè)原因。此外,Lact. fermentum 1001木糖操縱啟動(dòng)子(Plx)的活性在具有CCR的Lact.casei BL23中也未受到葡萄糖的抑制,而果糖操縱子的活性受到了松散抑制,表明啟動(dòng)子區(qū)域代謝物響應(yīng)元件(cre)的缺失也會(huì)影響CCR�？傊�,Lact. fermentum1001的木糖利用脫阻遏是由缺少cre和磷酸果糖激酶造成的。Lact. fermentum 1001缺少CCR,可以同時(shí)利用多種碳源以生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的。用Plx對(duì)乳酸菌進(jìn)行代謝工程改造,可以提高它們利用復(fù)雜碳源時(shí)的發(fā)酵效率。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q936
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本文編號(hào)：2288953