本文關(guān)鍵詞：利用基因組編輯技術(shù)針對(duì)豬H11位點(diǎn)的高效定點(diǎn)整合系統(tǒng)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林大學(xué)》 2015年

利用基因組編輯技術(shù)針對(duì)豬H11位點(diǎn)的高效定點(diǎn)整合系統(tǒng)的研究

阮進(jìn)學(xué)  

【摘要】：轉(zhuǎn)基因豬在農(nóng)業(yè)與醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著重要的作用。一方面豬作為一種重要的畜牧用物種，轉(zhuǎn)基因豬在肉質(zhì)的改良，生產(chǎn)性能的改進(jìn)，抗病育種上的應(yīng)用與環(huán)保育種的改善上起著關(guān)鍵的作用；另一方面，豬與人相對(duì)于人與小鼠等其他動(dòng)物更為接近，轉(zhuǎn)基因豬在醫(yī)學(xué)研究上也發(fā)揮著不小的作用，比如豬與人的器官大小接近，這一點(diǎn)使異種移植成為了可能，再者豬與人的各器官的結(jié)構(gòu)與血液生理生化指標(biāo)相似，轉(zhuǎn)基因豬成為更好的動(dòng)物模型，其在異種移植、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、老年癡呆癥等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有著較多的應(yīng)用。 盡管轉(zhuǎn)基因豬的在很多領(lǐng)域已經(jīng)得到應(yīng)用，然而卻依然受到一定的限制，轉(zhuǎn)基因的效率與整合位點(diǎn)的不確定性是主要原因。為了解決這一問(wèn)題，2014年賴良學(xué)課題組針對(duì)豬開發(fā)了Rosa26位點(diǎn)，他在其中引入了loxp位點(diǎn)，，并成功將RFP基因置換進(jìn)入并成功表達(dá)，使外源基因能在該位點(diǎn)高效表達(dá)。但是Rosa26是一個(gè)全身性表達(dá)的友好性基因，具有自己的Rosa26啟動(dòng)子，在該位點(diǎn)插入的基因往往會(huì)導(dǎo)致基因在全身性的廣泛表達(dá)，然而實(shí)際轉(zhuǎn)基因技術(shù)的運(yùn)用中往往僅僅需要組織特異性表達(dá)，該位點(diǎn)很難實(shí)現(xiàn)。 2010年，斯坦福大學(xué)的Simon Hippenmeyer及其研究團(tuán)隊(duì)在小鼠的第11號(hào)染色體上分離并鑒定出了一個(gè)良好的基因插入位點(diǎn)，命名為hipp11位點(diǎn)，簡(jiǎn)稱H11位點(diǎn)。H11位點(diǎn)位于Eif4enif1與Drg1兩個(gè)基因的間隙，與Eif4enif1基因的19號(hào)外顯子和Drg1基因的9號(hào)外顯子相鄰，大小約5kb。H11位點(diǎn)由于位于兩個(gè)基因之間，因此安全性較高，無(wú)基因沉默效應(yīng)，具有廣譜的細(xì)胞表達(dá)活性。 本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)人與小鼠尋找H11位點(diǎn)的經(jīng)驗(yàn)，在豬的第14號(hào)染色體鑒定出H11位點(diǎn)，并在5個(gè)豬品種中初步排除了SNP位點(diǎn)，其后對(duì)其進(jìn)行了初步分析。為了能夠?qū)⑼庠椿蚋咝У姆湃朐撐稽c(diǎn)中，我們采用了新型的基因編輯技術(shù)，針對(duì)豬的H11位點(diǎn)，H11位點(diǎn)設(shè)計(jì)了5對(duì)TALEN，1對(duì)CRISPR/Cas9n與2條CRISPR/Cas9，通過(guò)T7EI酶切法與測(cè)序法對(duì)他們的效率驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9的切割效率最高，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，Cas9-H11-g1切割效率達(dá)到了64%，之后根據(jù)2條CRISPR/Cas9的序列在豬的基因組中一共預(yù)測(cè)了23個(gè)可能的脫靶位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)T7EI酶切驗(yàn)證，沒(méi)有脫靶的現(xiàn)象發(fā)生。 其后我們根據(jù)篩選方法設(shè)計(jì)了2種打靶載體，分別利用正負(fù)篩選法，正篩選法與無(wú)藥物篩選法完成了細(xì)胞篩選，意在找到一種最高效的篩選方法。通過(guò)這三種篩選方法均篩選到陽(yáng)性克隆，其中正負(fù)篩選法的效率為23%，正篩選的效率為54%，無(wú)藥物篩選的效率達(dá)到了6%，經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn)通過(guò)正篩選法效率最高。 為了驗(yàn)證插入豬H11位點(diǎn)的基因能否高效的表達(dá)，我們以GFP為報(bào)告基因，并以CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)該基因，結(jié)果顯示所有的陽(yáng)性克隆均能夠高效的激發(fā)綠色熒光，且在利用該細(xì)胞制備胚胎后也能激發(fā)綠色熒光。其后我們利用該陽(yáng)性細(xì)胞借助體細(xì)胞核移植的方法成功制備出一頭健康的H11位點(diǎn)定點(diǎn)插入GFP基因的轉(zhuǎn)基因豬，我們對(duì)其個(gè)體，及心、肝、脾、肺、腎與肌肉的組織切片進(jìn)行熒光觀察，結(jié)果顯示GFP能高效表達(dá)，所以我們認(rèn)為豬的H11位點(diǎn)允許外源基因的高效表達(dá)。 該項(xiàng)成果在豬中找到并鑒定出H11位點(diǎn)，針對(duì)豬的H11位點(diǎn)設(shè)計(jì)并制備了多種基因編輯工具，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有最高的效率，依托該CRISPR/Cas9在三種篩選方式下完成篩選，證明正篩選法具有最高的效率，并且利用無(wú)藥物篩選法在豬中獲得定點(diǎn)敲入細(xì)胞系，該項(xiàng)研究成功將大片段的DNA（9kb）插入該位點(diǎn)，最后該研究證明插入該位點(diǎn)的外源基因能在細(xì)胞，胚胎與個(gè)體水平均能高效表達(dá)。 綜上所述，本研究依托基因組編輯技術(shù)針對(duì)豬H11位點(diǎn)創(chuàng)建了一個(gè)高效的定點(diǎn)整合系統(tǒng)，為今后轉(zhuǎn)基因豬安全、高效的的制備奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

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【共引文獻(xiàn)】

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1 張衛(wèi)紅;閆軍;馮沖;龍川;張兆旺;潘登科;;運(yùn)輸溫度與時(shí)間對(duì)豬孤雌胚胎發(fā)育的影響[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年13期

2 康錦丹;尹熙俊;趙明輝;梁爽;劉希;李文學(xué);崔成哲;;利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)表達(dá)紅色熒光蛋白的豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年12期

3 宋軍;王振坤;孔慶然;趙祥杰;劉麗清;田江天;鄭重;孫爽;尹智;劉忠華;;利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)表達(dá)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬胚胎的研究[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年03期

4 覃兆鮮;潘天彪;黃光云;謝炳坤;;豬Mx1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及其表達(dá)[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2011年04期

5 朱彥賓;龍川;馮沖;潘登科;羅玉柱;;Scriptaid處理可提高近交系五指山豬克隆胚胎的發(fā)育能力和克隆效率[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2011年03期

6 舒勤;朱京慈;;一氧化氮與高原肺水腫[J];高原醫(yī)學(xué)雜志;2009年01期

7 Wenteng He;Qingran Kong;Yongqian Shi;Bingteng Xie;Mingxia Jiao;Tianqing Huang;Shimeng Guo;Kui Hu;Zhonghua Liu;;Generation and Developmental Characteristics of Porcine Tetraploid Embryos and Tetraploid/diploid Chimeric Embryos[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

8 朱向星;全守能;黃勇;盧晟盛;;體細(xì)胞核移植技術(shù)在豬基因修飾中的應(yīng)用[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2013年06期

9 王春生;李詠樂(lè);仇雨歌;樸善花;安鐵洙;;轉(zhuǎn)甜味蛋白Brazzein基因乳腺特異表達(dá)載體的山羊體細(xì)胞株篩選[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年24期

10 朱向星;全守能;盧晟盛;;廣西巴馬小型豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的體外生產(chǎn)[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2015年01期

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1 崔奎青;轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆水牛與廣西水牛的遺傳特性研究[D];廣西大學(xué);2007年

2 黃黎珍;基因修飾克隆西藏小型豬研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

3 孔慶然;外源基因在轉(zhuǎn)基因豬中遺傳和表達(dá)的穩(wěn)定性[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 袁建龍;利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因絨山羊的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2013年

5 劉志國(guó);轉(zhuǎn)基因克隆豬的研制與ZFNs介導(dǎo)基因敲除的初步研究[D];中山大學(xué);2013年

6 郭戰(zhàn)軍;以納米材料作載體改進(jìn)精子介導(dǎo)法建立異種移植供體模型的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

7 杜新華;PiggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的脂肪代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因功能研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

8 吳正三;豬體細(xì)胞核移植相關(guān)影響因素的研究[D];廣西大學(xué);2013年

9 王令;鋅指核酸酶的構(gòu)建及其在動(dòng)物基因組編輯中的應(yīng)用[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

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1 鮑建昌;核成熟抑制劑對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟和發(fā)育能力的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

2 譚貝貝;轉(zhuǎn)基因克隆牛外源基因整合位點(diǎn)及拷貝數(shù)研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 宋軍;利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

4 劉曉輝;牛卵巢保存方法對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟和體外發(fā)育的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

5 曹愛巧;核供體細(xì)胞體外培養(yǎng)及其對(duì)豬克隆胚生產(chǎn)效率的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

6 孔慶然;轉(zhuǎn)基因豬中外源基因拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

7 張衛(wèi)紅;轉(zhuǎn)ω-3脂肪酸去飽和酶基因（sFat-1）的體細(xì)胞克隆豬制備過(guò)程中胚胎移植及脂肪酸檢測(cè)[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

8 汪慧;Noggin定點(diǎn)整合打靶載體的構(gòu)建及其體外轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2013年

9 魯月;利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)單體紅色熒光蛋白五指山小型豬研究[D];延邊大學(xué);2013年

10 孫毅;轉(zhuǎn)Cherry基因?qū)幭臑┭蝮w細(xì)胞核移植的研究[D];寧夏大學(xué);2013年

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1 ;轉(zhuǎn)基因豬皮研究獲得重大突破[J];藥物生物技術(shù);2001年01期

2 魏慶信,鄭新民,趙浩斌,華文君,李莉,田永祥,魏雁;轉(zhuǎn)基因豬研究進(jìn)展[J];中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志;2005年02期

3 張樹庸;;英國(guó)轉(zhuǎn)基因豬器官試驗(yàn)兩年內(nèi)完成[J];實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué);2009年03期

4 Vasil,ev,I,M.;;含有并表達(dá)人乙型肝炎病毒表面抗原基因的轉(zhuǎn)基因豬的制備[J];上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué);1991年01期

5 徐家立;轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)血紅蛋白開發(fā)[J];生物工程進(jìn)展;1992年01期

6 孫雷心;;轉(zhuǎn)基因豬——未來(lái)的供血者[J];生物技術(shù)通報(bào);1992年06期

7 孫雷心;取自轉(zhuǎn)基因豬的血液代用品[J];生物技術(shù)通報(bào);1993年04期

8 陶冶;在豬體內(nèi)高水平表達(dá)人血紅蛋白[J];生物技術(shù)通報(bào);1995年01期

9 王超,侍福梅;淺談轉(zhuǎn)基因豬的研究進(jìn)展[J];內(nèi)江科技;2005年03期

10 ;體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬在我國(guó)已發(fā)展成熟[J];中國(guó)豬業(yè);2008年01期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 魏慶信;鄭新民;趙浩斌;華文君;李莉;田永祥;魏雁;;轉(zhuǎn)基因豬研究進(jìn)展[A];中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)第六屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2004年

2 魏慶信;鄭新民;趙浩斌;華文君;李莉;田永祥;魏雁;;轉(zhuǎn)基因豬研究進(jìn)展[A];全國(guó)首屆動(dòng)物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

3 胡文萍;童佳;李秋艷;李寧;;轉(zhuǎn)基因豬乳腺表達(dá)重組人溶菌酶研究[A];中國(guó)動(dòng)物遺傳育種研究進(jìn)展——第十五次全國(guó)動(dòng)物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2009年

4 蔡偉光;丁景華;習(xí)欠云;肖敏;江青艷;吳珍芳;張永亮;;慢病毒與精子孵育法介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因豬的制備[A];全國(guó)動(dòng)物生理生化第十一次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2010年

5 芮榮;邱妍;胡元亮;范必勤;;豬轉(zhuǎn)基因胚胎生殖細(xì)胞的建系研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2004學(xué)術(shù)年會(huì)暨第五屆全國(guó)畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2004年

6 林育圣;楊卓真;鄭敬熏;鄭登貴;;藥用型及環(huán)保型轉(zhuǎn)基因家畜之研發(fā)[A];動(dòng)物生理生化學(xué)分會(huì)第八次學(xué)術(shù)會(huì)議暨全國(guó)反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理生化第三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2004年

7 鄭登貴;吳信志;沈朋志;林育圣;杜清富;林之任;林劭品;陳全木;陳銘正;馬春祥;;轉(zhuǎn)基因及復(fù)制豬于農(nóng)業(yè)及生物醫(yī)學(xué)之應(yīng)用[A];全國(guó)動(dòng)物生理生化第十二次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2012年

8 周均云;習(xí)欠云;蔡偉光;高萍;朱曉彤;束剛;王麗娜;王松波;江青艷;張永亮;;精子與慢病毒共孵育法制備轉(zhuǎn)基因豬的檢測(cè)[A];全國(guó)動(dòng)物生理生化第十二次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2012年

9 高飛;李小平;武蓉;段新平;閆森;李莉;王鐵東;賴良學(xué);歐陽(yáng)紅生;逄大欣;;鑒定轉(zhuǎn)基因豬整合位點(diǎn)的新方法[A];全國(guó)動(dòng)物生理生化第十一次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2010年

10 朱士恩;崔文濤;王建武;郭鑫;杜明;傅祥偉;;轉(zhuǎn)基因豬、牛和羊的環(huán)境安全評(píng)價(jià)技術(shù)研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物繁殖學(xué)分會(huì)第十六屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 蔡心軼 談潔;[N];中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào);2012年

2 本報(bào)記者 陳勇 通訊員 要毅 魯國(guó)梁 周金香;[N];湖北日?qǐng)?bào);2000年

3 張?zhí)锟?[N];科技日?qǐng)?bào);2000年

4 林儒忠;[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報(bào);2008年

5 ;[N];新華每日電訊;2008年

6 記者 馬桂花;[N];新華每日電訊;2008年

7 首席記者 任荃;[N];文匯報(bào);2009年

8 竇光宇;[N];中國(guó)國(guó)門時(shí)報(bào);2004年

9 劉霞;[N];科技日?qǐng)?bào);2011年

10 南方日?qǐng)?bào)記者 張勝波　雷雨 林亞茗;[N];南方日?qǐng)?bào);2010年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 程俊霖;GIPR功能顯性抑制的2型糖尿病轉(zhuǎn)基因豬模型的建立[D];南京醫(yī)科大學(xué);2014年

2 高卓;GalTKO.hCD46.hTM轉(zhuǎn)基因豬異種肺移植的初步研究及mfat-1轉(zhuǎn)基因小鼠血清中miRNAs的表達(dá)分析[D];南京醫(yī)科大學(xué);2014年

3 阮進(jìn)學(xué);利用基因組編輯技術(shù)針對(duì)豬H11位點(diǎn)的高效定點(diǎn)整合系統(tǒng)的研究[D];吉林大學(xué);2015年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 孔慶然;轉(zhuǎn)基因豬中外源基因拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

2 辛磊磊;轉(zhuǎn)植酸酶基因和抗粘液病毒基因豬環(huán)境安全評(píng)價(jià)[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

3 胡驍睿;單精注射制備轉(zhuǎn)基因豬胚胎技術(shù)的研究[D];浙江師范大學(xué);2014年

4 程妮;轉(zhuǎn)IGF-Ⅰ基因豬安全性評(píng)價(jià)[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

5 翟珊莉;5種轉(zhuǎn)基因豬、牛、山羊外源核酸快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確檢測(cè)方法的建立[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

6 高輝;轉(zhuǎn)PEPCK-1基因豬的生物安全評(píng)價(jià)[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

7 戴禎;shRNA對(duì)轉(zhuǎn)基因豬的毒性研究[D];吉林大學(xué);2014年

8 陳曉亮;一種抗蛋白酶的植酸酶轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞系的建立[D];廣西大學(xué);2012年

9 宋德超;孕酮誘導(dǎo)HOXa-10基因表達(dá)及轉(zhuǎn)基因豬制備研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

10 邱青松;轉(zhuǎn)FSHα/β基因克隆豬分子鑒定及常規(guī)生理生化指標(biāo)測(cè)定[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：227398