【摘要】：光作為能量與信息的攜帶者,不僅可以通過光合作用轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,為生物體提供能量,還可以通過感光受體對生物體的生理過程進(jìn)行調(diào)節(jié)。藍(lán)細(xì)菌作為光合作用的模式生物,主要由藻膽體捕獲光能。為了提高光合效率,藍(lán)細(xì)菌在長期的自然選擇過程中進(jìn)化出了一套由藍(lán)細(xì)菌光敏色素識別和響應(yīng),從而調(diào)節(jié)藻膽體重構(gòu)的機(jī)制。在藻膽體中,有一種核膜連接蛋白(ApcE),作為藻膽體的能量傳遞終端,特征吸收峰及熒光峰均比其他藻膽蛋白更為紅移,這種特性使得其進(jìn)化為近紅外熒光探針具有一定的優(yōu)勢。而藍(lán)細(xì)菌光敏色素(CBCR)可以響應(yīng)光的變化,這使得其適合發(fā)展成為光控開關(guān)探針。在普通的藍(lán)細(xì)菌中,共價連接藻藍(lán)膽素的核膜連接蛋白(ApcE1)最大吸收峰在660 nm,最大熒光峰在675 nm。近期發(fā)現(xiàn)了一類可以利用近紅外光進(jìn)行光合作用的藍(lán)細(xì)菌,并在這類藍(lán)細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了吸收峰大于700 nm,熒光峰大于710 nm的組分。Synechococcus sp.PCC7335就屬于這類藍(lán)細(xì)菌。通過序列比對,在這個藻中找到了一個沒有保守性半胱氨酸的核膜連接蛋白(ApcE2),可能與紅移的組分有關(guān)。為了證實其特征吸收峰及特征熒光峰是否發(fā)生紅移,將其N端結(jié)合色素的結(jié)構(gòu)域(1-273)克隆至表達(dá)載體并與產(chǎn)生色素PCB、PEB、PФB的色素合成酶在大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá),產(chǎn)生的色素蛋白的最大吸收峰分別在700 nm、615 nm和711 nm,最大熒光峰分別在714 nm、628 nm和726 nm,相比較典型的ApcE1,特征峰均紅移了近40 nm。由于雙體的PCB-ApcE2(1-273)與之后經(jīng)過截短的單體PCB-ApcE2(24-245)最大吸收峰均在700 nm,最大熒光峰均在714 nm,因此排除了激子耦合而引起光譜紅移的可能性。經(jīng)過酸性尿素變性實驗、蛋白膠的醋酸鋅染色及氯仿萃取實驗,證明了光譜的紅移主要是由于色素與蛋白的非共價連接,進(jìn)而保留了色素△3,31間的雙鍵,使得共軛雙鍵的長度增長導(dǎo)致的。這種不需要裂合酶的催化、非共價的色素化為近紅外熒光團(tuán)的開發(fā)提供了新的思路。為了驗證ApcE2作為熒光探針的潛力,將色素合成酶的基因與ApcE2構(gòu)建到一個質(zhì)粒上進(jìn)行標(biāo)記,在大腸桿菌中得到成功運(yùn)用。為了進(jìn)一步將其優(yōu)化成近紅外熒光探針,對ApcE2進(jìn)行了定點誘變,得到了可以非共價連接膽綠素的誘變體,使最大熒光峰更進(jìn)一步紅移至730 nm。為了拓展應(yīng)用范圍,嘗試通過體外添加色素與體內(nèi)合成色素兩種方式提供發(fā)色團(tuán),在動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá),雖然沒有檢測到熒光,但這些工作為下一步優(yōu)化研究奠定了基礎(chǔ)。Chr.thermalis PCC 7203也是一種可以利用近紅外光進(jìn)行光合作用的藻,通過序列比對我們發(fā)現(xiàn)了一個別藻藍(lán)蛋白ApcF2,其與前面研究的ApcE2類似,也沒有保守半胱氨酸。為了檢測其光譜性質(zhì)是否適合作為近紅外熒光探針,在大腸桿菌中共表達(dá)ApcF2和合成色素的酶,產(chǎn)生的色素蛋白PCB-ApcF2最大吸收峰在674 nm,最大熒光峰在700 nm,酸性尿素變性實驗證明了色素與蛋白的連接亦是非共價的。為了進(jìn)一步將其開發(fā)為近紅外熒光探針,對蛋白不保守的N端氨基酸進(jìn)行了缺失,結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙體的ApcF2也可以變?yōu)閱误w,并發(fā)現(xiàn)N端截短的氨基酸在保持蛋白的活性及色素的穩(wěn)定性方面存在重要作用。相比較ApcE2,ApcF2在進(jìn)化為近紅外熒光探針方面更具優(yōu)勢:ApcF2分子量更小,且蛋白可溶性非常好,在較寬的pH范圍內(nèi)依然保持較高的活性,故運(yùn)用范圍更廣。在本章實驗中,還對大腸桿菌的膜進(jìn)行了標(biāo)記,并運(yùn)用熒光顯微鏡觀察到了熒光,這為下一步在動物細(xì)胞中的標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。在對ApcF2(20-169)進(jìn)行隨機(jī)誘變的實驗中,我們得到了光譜藍(lán)移、熒光量子產(chǎn)率更高的誘變體,這為更進(jìn)一步進(jìn)行雙色標(biāo)記提供了原材料。近年來,將光敏色素作為光受體來構(gòu)建光遺傳學(xué)工具的研究越來越多。由于動物組織對可見光的不可透性及紅外線的強(qiáng)烈衰減性,使得對遠(yuǎn)紅及近紅外光響應(yīng)的光受體越來越受重視。本研究中,我們從來源于Synechocystis sp.PCC6803中的藍(lán)細(xì)菌光敏色素1393gaf3出發(fā)進(jìn)行分子進(jìn)化,嘗試尋找到對遠(yuǎn)紅及近紅外光響應(yīng)的誘變體。通過對誘變位點及光譜的分析,找到了有關(guān)于光譜變化及保持蛋白活性的關(guān)鍵位點,為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q945

【參考文獻(xiàn)】

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1 馬瓊;藍(lán)細(xì)菌光敏色素的光化學(xué)性質(zhì)與Slr0351功能的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

2 陳煜;藍(lán)細(xì)菌光敏色素及藻紅蛋白的生物合成研究[D];華中科技大學(xué);2012年

3 蘇平;藍(lán)藻藻藍(lán)蛋白和變藻藍(lán)蛋白生物合成的研究[D];華中科技大學(xué);2008年

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本文編號：2258954