【摘要】：鈉肽受體2 (natriuretic peptide receptor 2, NPR2)在維持卵母細胞減數(shù)分裂阻滯中起著關(guān)鍵的作用。本課題研究了NPR2在精子上的表達特征、功能及作用機制,同時利用卵丘卵母細胞復(fù)合體的體外培養(yǎng)模型研究了NPR2失活的調(diào)節(jié)機制。哺乳動物交配后,射入雌性生殖道的幾百萬精子快速到達輸卵管峽部儲存起來,只有當(dāng)排卵發(fā)生時,才有少數(shù)獲能精子恢復(fù)運動能力,向受精部位壺腹部運動,最終與卵母細胞相遇,導(dǎo)致受精。該現(xiàn)象通常被稱為精子趨化作用。采用免疫沉淀和蛋白免疫印跡的方法,發(fā)現(xiàn)NPR2主要表達在精子尾部,而使用熒光標(biāo)記的配體C-型鈉肽(Natnuretic peptide type C, NPPC),即FAM-NPPC,進行結(jié)合實驗,發(fā)現(xiàn)FAM-NPPC主要結(jié)合在小鼠精子尾部中段,表明NPR2表達在小鼠精子尾部中段。NPR2的配體NPPC在青春期小鼠輸卵管中表達很低,在排卵后輸卵管壺腹部的表達顯著增加。免疫組化實驗表明NPPC蛋白定位在輸卵管壺腹部的黏膜層細胞中。NPPC能夠增加精子平均路徑速度VAP,直線運動速度VSL及進行性運動的精子比率。采用毛細管趨化模型來研究NPPC對小鼠精子的趨化作用,結(jié)果表明NPPC能夠誘導(dǎo)精子在毛細管中的積累。進一步研究發(fā)現(xiàn),NPPC與精子上的NPR2結(jié)合,能夠引起精子胞內(nèi)cGMP水平的升高。NPPC能誘導(dǎo)精子胞內(nèi)鈣離子水平的升高,并且鈣離子升高的應(yīng)答首先出現(xiàn)在精子尾部中段,隨后傳播到了精子頭部。cGMP類似物8-Br-cGMP能夠模擬NPPC的作用,引起精子的積累和胞內(nèi)鈣離子水平的升高。NPPC不能誘導(dǎo)Npr2ca-2J/Npr2cn-2J突變鼠精子積累,而且Npr2cn-2J /Npr2cn-2J突變鼠精子人工輸精的受精率非常低(Npr2cn-2J/Npr2n-2J,5.4±2.2%; Npr2wt/Npr2cn-2J,77.7±3.40%)。因此排卵發(fā)生時,精子上的NPR2與壺腹部來源的配體NPPC結(jié)合,通過cGMP-Ca2+信號通路誘導(dǎo)精子朝向壺腹部的卵母細胞運動,這對于排卵和受精的同步化及正常受精是非常重要的。為了研究NPR2失活的機理,我們利用卵丘卵母細胞復(fù)合物的體外培養(yǎng)模型進行實驗。NPR2與NPPC結(jié)合產(chǎn)生的cGMP維持了卵母細胞減數(shù)分裂的阻滯。本研究表明EGF能夠引起卵丘細胞中鈣離子水平升高,導(dǎo)致NPR2的失活。鈣離子激動劑離子霉素(ionomycin)和磷酸鞘氨醇(lipid sphingosine-1-phosphate, SIP)能模擬EGF的作用。說明NPR2與NPPC結(jié)合誘導(dǎo)了卵丘細胞中鈣離子水平的升高,導(dǎo)致了NPR2的失活。以上結(jié)果說明NPR2表達在精子尾部中段,通過結(jié)合NPPC,產(chǎn)生cGMP,促進了胞外鈣離子內(nèi)流,增加了精子的活力,誘導(dǎo)精子朝向卵母細胞趨化運動,完成受精。卵丘細胞中的鈣離子水平的升高導(dǎo)致了NPR2鳥苷酸環(huán)化酶的失活。利用NPR2在精子趨化中的作用,對于未來篩選優(yōu)質(zhì)的精子進行體外受精及制備避孕藥有著很好的應(yīng)用前景。
[Abstract]:Natriuretic peptide receptor 2 (NPR2) plays a key role in maintaining meiotic arrest in oocytes. In this study, the expression, function and mechanism of NPR2 in spermatozoa were studied, and the regulation mechanism of NPR2 inactivation was studied by using cumulus oocyte complex culture model in vitro. After mating in mammals, millions of sperm injected into the female reproductive tract reach the isthmus of the fallopian tube for storage. Only when ovulation occurs does a few of the capacitated sperm recover their motility and move toward the ampulla, where they are fertilized. Eventually, it meets oocytes and results in fertilization. This phenomenon is often referred to as sperm chemotaxis. By immunoprecipitation and Western blotting, we found that NPR2 was mainly expressed in the tail of spermatozoa, while FAM-NPPC, a fluorescent labeled ligand of C- type natriuretic peptide (Natnuretic peptide type C, NPPC), was used to carry out binding experiments. It was found that FAM-NPPC was mainly bound to the middle part of mouse sperm tail. The results showed that the expression of NPR2 was very low in the oviduct of puberty mice, and increased significantly after ovulation. Immunohistochemical study showed that the localization of NPPC protein in the mucosal layer cells of the ampulla of fallopian tube could increase the average speed of sperm pathway, the velocity of linear motion, VSL, and the rate of progressive motility of spermatozoa. The chemotactic effect of NPPC on mouse spermatozoa was studied by capillary chemotaxis model. The results showed that NPPC could induce the accumulation of spermatozoa in capillaries. Furthermore, it was found that the combination of NPR2 with NPR2 in spermatozoa could induce the increase of intracellular cGMP level in spermatozoa. NPPC could induce the increase of intracellular calcium level in sperm, and the response of increased calcium ion first appeared in the middle part of sperm tail. Then it was transmitted to the sperm head. 8-Br-cGMP, an analogue of cGMP, could mimic the effect of NPPC and induce the accumulation of spermatozoa and the increase of intracellular calcium level. NPPC could not induce the accumulation of sperm in Npr2ca-2J/Npr2cn-2J mutant mice. Moreover, the fertilization rate of Npr2cn-2J / Npr2cn-2J mutant spermatozoa was very low (Npr2cn-2J / Npr2n-2J = 5.4 鹵2.2; Npr2wt / Npr2cn-2JN 77.7 鹵3.40%). Therefore, during ovulation, NPR2 on the sperm binds to the ligand NPPC from the ampulla, which induces the oocyte movement towards the ampulla through the cGMP-Ca2 signaling pathway, which is very important for the synchronization of ovulation and fertilization and normal fertilization. In order to study the mechanism of NPR2 inactivation, we used the cumulus oocyte complex culture model in vitro to carry out the experiment. The cGMP produced by the combination of NPR2 and NPPC maintained the block of meiosis of oocytes. This study suggests that EGF can increase calcium level in cumulus cells and lead to NPR2 inactivation. Calcium agonists, ionomycin (ionomycin) and lipid sphingosine-1-phosphate (SIP) can mimic the effects of EGF. These results suggest that the combination of NPR2 and NPPC induces the increase of calcium ion level in cumulus cells and leads to the inactivation of NPR2. These results suggest that NPR2 is expressed in the middle part of the sperm tail. By combining with NPR2, cGMPs are produced, which promote the influx of extracellular calcium ions, increase the motility of sperm, induce sperm to move towards oocytes, and complete fertilization. Increased calcium levels in cumulus cells resulted in inactivation of NPR2 guanosine cyclase. The role of NPR2 in sperm chemotaxis has a good prospect for the future screening of high quality spermatozoa for in vitro fertilization and the preparation of contraceptive pills.
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q492

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 吳靖;;精子發(fā)生的計算機模型[J];國外醫(yī)學(xué).生物醫(yī)學(xué)工程分冊;1991年02期

2 張桂元;關(guān)于精子發(fā)生、附睪精子成熟和精子功能的研究課題基金資助申請[J];實用男科雜志;1997年02期

3 李碧春,錢菊汾;精子介導(dǎo)外源DNA轉(zhuǎn)移的研究進展[J];動物醫(yī)學(xué)進展;2000年04期

4 單玉喜,晏鵬,吳孝兵,李建民;人類Y染色體上與精子發(fā)生相關(guān)的基因的研究進展[J];安徽師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2001年02期

5 單玉喜,吳孝兵;差異顯示法克隆精子發(fā)生相關(guān)基因[J];中華男科學(xué);2001年01期

6 白文俊,侯樹坤,王曉峰,閆征,何培英,田世河,鄧慶平;腫瘤壞死因子受體在人精子的表達及其意義[J];中華泌尿外科雜志;2002年03期

7 李澤廷;桂耀庭;蔡志明;;精子發(fā)生中幾個關(guān)鍵基因的研究進展[J];國際泌尿系統(tǒng)雜志;2006年02期

8 侯仕農(nóng);高雪梅;閆強;;精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進展[J];華北農(nóng)學(xué)報;2006年S3期

9 周興;張居農(nóng);;精子載體轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進展[J];中國奶牛;2007年08期

10 周興;張居農(nóng);;精子載體轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進展[J];吉林農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 桂耀庭;唐愛發(fā);余振東;張立兵;張鍵榮;李賢新;蔡志明;;精子發(fā)生相關(guān)基因的篩選和功能研究[A];中國生理學(xué)會2007年消化內(nèi)分泌生殖學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2007年

2 王暉;徐珉;李建民;肖俊華;許志洋;周作民;沙家豪;;人精子發(fā)生相關(guān)基因精子表達譜系的建立及初步臨床應(yīng)用[A];第九次全國生殖生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2003年

3 王暉;周作民;徐珉;李建民;沙家豪;;人精子中精子發(fā)生相關(guān)基因譜系的構(gòu)建及初步臨床應(yīng)用[A];江蘇省遺傳學(xué)會第七屆代表大會暨學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2006年

4 高永金;金保方;;精子DNA完整性損傷及其相關(guān)性研究進展[A];2011·中國醫(yī)師協(xié)會中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)師大會論文集[C];2011年

5 高永金;金保方;;精子DNA完整性損傷及其相關(guān)性研究進展[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會第十一屆男科學(xué)術(shù)大會論文集[C];2011年

6 張美佳;洪海燕;周波;金世英;王超;傅茂勇;王松波;夏國良;;心鈉肽在豬輸卵管中的表達以及其對精子功能的影響[A];第十屆全國生殖生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2005年

7 孫中明;;精子超微結(jié)構(gòu)與男性不育[A];浙江省中醫(yī)藥學(xué)會2005年男科中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合學(xué)術(shù)交流會資料匯編[C];2005年

8 賈孟春;;精子發(fā)生及其激素調(diào)節(jié)[A];第二屆全國不育癥研討會論文匯編[C];2007年

9 桂耀庭;唐愛發(fā);余振東;張立兵;張鍵榮;李賢新;蔡志明;;精子發(fā)生相關(guān)基因的篩選和功能研究[A];第一屆中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會、中國動物學(xué)會生殖生物學(xué)分會聯(lián)合年會論文匯編[C];2007年

10 張立營;曾梅;孫華欽;陳樸;張思仲;馬用信;;小鼠T-STAR蛋白靶mRNAs的分離及鑒定[A];中國遺傳學(xué)會第八次代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院上海市人類精子庫 杜宏偉　上海市男科學(xué)研究所 李錚;人體最激情的舞者——精子[N];東方早報;2011年

2 記者 劉澤林;“準精子”在猴類體外培育成功[N];健康報;2013年

3 本報記者 董毅然;精子危機會讓人類斷子絕孫嗎[N];北京科技報;2004年

4 河北農(nóng)大動科院 王立澤 王建濤 張國賓;給狐采精勿棄精清[N];河北科技報;2007年

5 劉長亮;“附睪炎致不孕”內(nèi)幕揭秘[N];農(nóng)村醫(yī)藥報（漢）;2008年

6 汪文;做個準爸爸，，你準備好了嗎？[N];江蘇科技報;2000年

7 段恩奎;人造精子用于臨床不能過于樂觀[N];科技日報;2006年

8 劉遠橋邋鄒爭春;為準爸爸開具營養(yǎng)處方[N];科技日報;2007年

9 潘文;對人工精子的臨床前景不能過于樂觀[N];中國醫(yī)藥報;2006年

10 黃力;準爸爸要早做準備[N];保健時報;2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 侯聰聰;十足目甲殼動物頂體構(gòu)架體及精子發(fā)生相關(guān)蛋白功能研究[D];浙江大學(xué);2015年

2 張順;單精子胞質(zhì)內(nèi)注射轉(zhuǎn)基因法（ICSI-MGT）生產(chǎn)轉(zhuǎn)Fat-1基因兔的初步研究[D];廣西大學(xué);2013年

3 庫爾班·吐拉克;塔里木馬鹿（Cervus elaphus yarkandensis）精子體外獲能及其相關(guān)蛋白酪氨酸磷酸化研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

4 訾振振;Ccnyl1在精子發(fā)生過程中的功能研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

5 祁琳;小鼠與人睪丸磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

6 湯克瓊;GDF9對牛卵泡和胚胎發(fā)育及精子發(fā)生的作用及其機制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

7 孔娜娜;鈉肽受體2在精子趨化中的作用和機制[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

8 韋有衡;以小鼠為模型的睪丸特異表達激酶TSSK5的功能研究[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

9 張浩波;精子凋亡與男性不育相關(guān)系列研究[D];山東大學(xué);2007年

10 李純錦;牛和人精子中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子的表達及功能研究[D];吉林大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 馬媛媛;綿羊Spesp1的cDNA克隆以及與其他精卵融合相關(guān)精子蛋白的相互作用[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

2 王海玲;莠去津?qū)有肪用富钚�、DNA完整性及組蛋白表達的影響[D];河北大學(xué);2015年

3 丹彤;綿羊Izumo2的cDNA克隆、在睪丸和精子上的定位觀察及與其它精卵融合相關(guān)蛋白相互作用的初步篩選[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

4 田宇;低溫處理對豬精子泛素化水平及體外受精的影響[D];延邊大學(xué);2015年

5 楊向yN;冷凍技術(shù)對精子印記基因DNA甲基化及結(jié)構(gòu)影響的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

6 朱振東;褪黑色素對兔精子冷凍保存效果的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

7 陳鵬;小鼠精干細胞系和睪丸ECM體外3D培養(yǎng)體系的建立[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

8 范楚寧;半胱氨酸對獺兔精液冷凍保存效果的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

9 張妍;易感基因核苷酸多態(tài)性對中國漢族男性精子發(fā)生障礙的影響[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

10 閆慧;小鼠精子發(fā)生過程中dysbindin-1的表達[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

本文編號：2152539