發(fā)布時間：2016-12-16 08:00

  本文關(guān)鍵詞：基于原子力顯微鏡的單分子力譜對蛋白質(zhì)的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《南京大學(xué)》 2015年

基于原子力顯微鏡的單分子力譜對蛋白質(zhì)的研究

高翔  

【摘要】：蛋白質(zhì)是一類非常重要的生物大分子,在物質(zhì)代謝、細(xì)胞信息傳遞、個體生長發(fā)育等方面均有不可替代的作用。單分子力譜被廣泛地用于表征蛋白質(zhì)在其生理環(huán)境下的構(gòu)象變化,從而研究機械力對結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控作用。一方面,為了行使蛋白質(zhì)的正常生物功能,蛋白質(zhì)需要和多不同的配體蛋白相互作用,并在作用過程中發(fā)生變構(gòu)以實現(xiàn)其功能或者將信號傳遞出去。蛋白質(zhì)和配體結(jié)合過程中會在相互作用表面發(fā)生形變以適應(yīng)它的配體,因此蛋白質(zhì)的柔性是蛋白和配體結(jié)合中一個很重要的因素。我們研究了一種可以和多個配體結(jié)合的蛋白ARNT PAS-B,發(fā)現(xiàn)其柔性非常強,蛋白的N端和C端在存在拉力的時候距離可以增加75%,而蛋白本身不發(fā)生解折疊,這一發(fā)現(xiàn)可以解釋PAS-B和不同配體結(jié)合的機理,另外,我們還發(fā)現(xiàn)了該蛋白在力學(xué)解折疊過程中存在一個短暫的中間態(tài),蛋白的力學(xué)解折疊過程將沿著兩態(tài)或者三態(tài)過程發(fā)生,解折疊過程中存在動力學(xué)分配的行為。另一方面,許多生物大分子通過機械力來調(diào)控其結(jié)構(gòu)與生物功能。它們能夠產(chǎn)生,感應(yīng),傳遞和響應(yīng)力學(xué)信號,并且做出相應(yīng)的構(gòu)象變化。除了蛋白和蛋白相互作用產(chǎn)生的拉力,含有多個結(jié)構(gòu)域的蛋白內(nèi)部也存在張力,這樣一種張力是否在會影響蛋白質(zhì)動力學(xué)和功能目前還不清楚。我們對人體內(nèi)凝溶膠蛋白進(jìn)行了單分子力譜測量,發(fā)現(xiàn)凝溶膠蛋白在拉力作用下對鈣離子的結(jié)合強度大幅度增加,當(dāng)拉力僅為十皮牛時解離常數(shù)降低了六倍。凝溶膠蛋白在去激活態(tài)時內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)域之間可能存在張力,我們推測,正是由于這種力學(xué)加強的配體結(jié)合機理和蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)域間的張力增加了凝溶膠蛋白的激活過程中的協(xié)同性。本論文主要內(nèi)容如下：第一章主要介紹了單分子力譜的發(fā)明發(fā)展和工作原理,簡單回顧了蛋白質(zhì)的折疊動力學(xué)以及力學(xué)信號對蛋白質(zhì)功能的影響。并介紹了單分子力譜的數(shù)據(jù)處理方法和一些常用的模型。然后我列舉了一系列優(yōu)秀的單分子力譜的工作,回顧了單分子力譜研究的發(fā)展。第二章主要內(nèi)容為：對人體內(nèi)芳烴受體核轉(zhuǎn)運蛋白(ARNT) PAS-B結(jié)構(gòu)域的單分子力譜工作。PAS (Per-ARNT-Sim)結(jié)構(gòu)域是一個存在于信號傳導(dǎo)蛋白中的可以和多種配體結(jié)合的蛋白模體。它可以對非常多的化學(xué)和物理信號進(jìn)行相應(yīng)。雖然它的功能多樣,但是PAS結(jié)構(gòu)域有相對保守的結(jié)構(gòu)。有研究推測PAS結(jié)構(gòu)域是柔軟的,所以可以適應(yīng)不同的結(jié)合配體。但是,目前為止還沒有對PAS結(jié)構(gòu)域柔性的直接測量結(jié)果。這里,我們使用單分子原子力顯微鏡定量測量了一種PAS結(jié)構(gòu)域,ARNT PAS-B,的力學(xué)解折疊。我們的力譜數(shù)據(jù)顯示ARNT PAS-B結(jié)構(gòu)域可以被小于30 pN的拉力解折疊,如此小的解折疊力是源自其較寬的解折疊勢井,其解折疊勢井的寬度大約為2 nm。這個性質(zhì)將允許PAS-B結(jié)構(gòu)域的N端和C端在受力的時候被拉伸75%,而自身不發(fā)生解折疊。另外,我們發(fā)現(xiàn)ARNT PAS-B結(jié)構(gòu)域通過一種動力學(xué)分配機(kinetic partitioning mechanism)沿著兩條不同的路徑解折疊。百分之六十七的ARNT PAS-B蛋白沿著一條較簡單的兩態(tài)路徑發(fā)生解折疊,而另外的百分之三十三在解折疊時則會首先到達(dá)一個結(jié)構(gòu)確定的中間態(tài),該中間態(tài)是折疊態(tài)蛋白的C端發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開產(chǎn)生的。我們猜想PAS-B結(jié)構(gòu)域的這種結(jié)構(gòu)柔性和力引發(fā)的部分解折疊現(xiàn)象可能提供一種特別的配體招募機制,以招募多種多樣的配體分子,并降低其配體結(jié)合表面(binding surface)構(gòu)象變化的自由能壘。第三章主要內(nèi)容為：單分子力譜實驗揭示出凝溶膠蛋白的鈣離子結(jié)合的力學(xué)增強效應(yīng)。越來越多的人意識到力在生物過程中起到非常重要的作用。力可以解折疊天然態(tài)蛋白質(zhì),導(dǎo)致蛋白質(zhì)特有的力學(xué)響應(yīng)。蛋白-蛋白結(jié)合親和性可能會降低,或者在拉力作用在其中一個或者兩者之上時,導(dǎo)致新的蛋白-蛋白相互作用位點被暴露出來。這里我們的實驗證明,凝溶膠蛋白(gelsolin)的第六個結(jié)構(gòu)域(G6)可以在機械力作用下提高其與鈣離子的親和性。我們的動力學(xué)模型表明G6蛋白的鈣離子親和性隨著拉力的增加而呈指數(shù)性的增長,這種增長將一直持續(xù)到G6蛋白發(fā)生力學(xué)解折疊。這表明在拉伸力存在時,凝溶膠蛋白可能在更低的鈣離子水平下被激活。這種陽離子-蛋白結(jié)合親和性受力學(xué)調(diào)控的結(jié)論提供給我們在有應(yīng)力的細(xì)胞環(huán)境中,比如細(xì)胞骨架豐富的區(qū)域或者細(xì)胞粘附區(qū)域,陽離子調(diào)控蛋白的復(fù)合體行為一種新的理解。第四章的主要內(nèi)容為：我們通過原子力顯微鏡對配體調(diào)控的SH3蛋白的力學(xué)各向異性進(jìn)行了研究。我們已經(jīng)知道,力在生物過程中起到不可缺少的作用。力可以引起蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化,可以導(dǎo)致蛋白的力學(xué)解折疊以及各種各樣效應(yīng)。隨著單分子力譜技術(shù)的發(fā)展,我們可以詳細(xì)的研究蛋白質(zhì)分子的的力學(xué)性質(zhì)。尤其是隨著半胱氨酸對交聯(lián)技術(shù)(double-cysteine crosslinking method)的發(fā)明,力可以施加在蛋白的各個方向。有研究表明,蛋白質(zhì)的力學(xué)穩(wěn)定性是各向異性的,依賴于施加力的方向。同時,也有研究表明配體結(jié)合可以有效的增加蛋白的穩(wěn)定性。但是,目前仍然缺少配體調(diào)控的穩(wěn)定性在不同拉伸方向上產(chǎn)生的效果的研究。這里,我們通過基于原子力顯微鏡的單分子力譜研究了SH3各項異性對拉伸方向的響應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)在幾個拉伸方向上,配體對SH3蛋白的影響各不相同,并且和最開始的力學(xué)穩(wěn)定性無關(guān)。在400nm/s的拉伸速度下,解折疊力的增加從5%到80%不等。更加細(xì)節(jié)的研究表明給出了如下結(jié)論：第一,為了使蛋白可以在不同拉伸方向下進(jìn)行研究,我們的突變將導(dǎo)致配體無法和蛋白結(jié)合,這就導(dǎo)致了蛋白在加入配體之后解折疊力不發(fā)生變化。二,配體和蛋白結(jié)合之后穩(wěn)定性都會增加,但是增加的穩(wěn)定性和原本的穩(wěn)定性無關(guān),只和位置有關(guān)。三,蛋白質(zhì)的解折疊距離不發(fā)生變化,也就是說蛋白的解折疊路徑?jīng)]有發(fā)生變化。這些發(fā)現(xiàn)提供了我們對力學(xué)調(diào)控和配體調(diào)控的耦合的生物學(xué)過程提供了新的理解。第五章我總結(jié)博士生期間的工作,給出了將來的研究計劃。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q51
【目錄】：

下載全文 更多同類文獻(xiàn)

CAJ全文下載

(如何獲取全文？ 歡迎：購買知網(wǎng)充值卡、在線充值、在線咨詢)

CAJViewer閱讀器支持CAJ、PDF文件格式

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王佳;李雨;李明娟;閔銳;;輻射誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)凝溶膠蛋白變化及其對小鼠氧化損傷的影響[J];輻射研究與輻射工藝學(xué)報;2011年04期

2 王壽勇;馬琳玉;王穎;張洲;鄧薇菲;;大鼠體外循環(huán)前后血漿蛋白質(zhì)差異性表達(dá)[J];重慶醫(yī)學(xué);2015年10期

3 陳蕾;李曄;蘇秀榕;江錦坡;李太武;李振;周君;劉艷;夏長革;;浙江枝吻紐蟲(Dendrorhynchus zhejiangensis)凝溶膠蛋白和肌動蛋白基因的克隆與序列分析[J];海洋與湖沼;2011年02期

4 李曄;陳蕾;李振;蘇秀榕;周君;李太武;江錦坡;;浙江枝吻紐蟲(Dendrorhynchus zhejiangensis)凝溶膠蛋白基因的原核表達(dá)產(chǎn)物抗腫瘤活性的研究[J];海洋與湖沼;2012年04期

5 潘潔;鐘方芳;王紅艷;黃仲賢;譚相石;;可溶性鳥苷酸環(huán)化酶介導(dǎo)NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及其分子機制研究[J];中國科學(xué):化學(xué);2014年04期

6 PAN Yan Gang;WANG Feng;LIU Yan Hou;YANG Yong-Guang;WANG Hong Da;;Single-molecule-force spectroscopy study of the mechanism of interactions between TSP-1 and CD47[J];Science China(Chemistry);2014年12期

7 周素平;;齒垢密螺旋體雙組分調(diào)控系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J];口腔醫(yī)學(xué);2015年07期

8 王旭濤;張新超;;凝溶膠蛋白和危重病[J];中國全科醫(yī)學(xué);2009年22期

9 陳壯飛;肖耀軍;鄭少斌;趙善超;姜耀東;秦自科;毛向明;;腎癌組織中CapG蛋白的表達(dá)變化及臨床意義[J];山東醫(yī)藥;2011年22期

10 李明娟;閔銳;;凝溶膠蛋白及其生物醫(yī)學(xué)作用[J];生命科學(xué);2010年03期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 阿斯瑪·薩利姆·卡茲;不同淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白亞細(xì)胞組分表達(dá)與淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)性的比較分析[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年

2 吳瀅;表皮生長因子對腎小球上皮影響的實驗研究[D];復(fù)旦大學(xué);2005年

3 鄧飛艷;骨質(zhì)疏松癥和良性家族性成年人肌陣攣癲癇的基因定位和鑒定[D];湖南師范大學(xué);2006年

4 關(guān)印;單核苷酸多態(tài)與含鉑方案治療小細(xì)胞肺癌療效及預(yù)后的關(guān)聯(lián)研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

5 王紹清;Gelsolin降低小鼠肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移力Hca-F細(xì)胞株的侵襲和運動能力[D];大連醫(yī)科大學(xué);2009年

6 肖飛;耐藥性癲癇患者腦組織和腦脊液中生物標(biāo)記物的篩選及臨床價值研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2009年

7 劉玥;血小板骨架蛋白Gelsolin在冠心病血瘀證中的作用及赤芍川芎有效組分的干預(yù)效應(yīng)研究[D];中國中醫(yī)科學(xué)院;2012年

8 鞠濤;機器人輔助生物細(xì)胞光學(xué)操作中運動規(guī)劃[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2013年

9 孟偉;化學(xué)修飾和滲透劑影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和折疊動力學(xué)的研究[D];南京大學(xué);2013年

10 呂春梅;利用單分子力譜研究凝溶膠蛋白的力學(xué)性質(zhì)[D];南京大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張云良;胃癌組織中BRMS1，GELSOLIN，uPA蛋白表達(dá)及意義研究[D];泰山醫(yī)學(xué)院;2010年

2 王旭濤;凝溶膠蛋白在危重癥患者病情嚴(yán)重程度與預(yù)后評估中的價值[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2010年

3 李明娟;DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白基因表達(dá)與輻射劑量關(guān)系研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

4 石錦平;利用秀麗線蟲研究腦紅蛋白的抗氧化損傷作用及細(xì)胞骨架蛋白的缺氧應(yīng)答機制[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

5 劉權(quán)威;基于通路分析的中國漢族人群身高全基因組關(guān)聯(lián)研究[D];湖南師范大學(xué);2011年

6 邵琳;gelsolin、cyclinD1在卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá)及其意義[D];山東大學(xué);2011年

7 陳屹一;肝衰竭患者外周血維生素D結(jié)合蛋白水平與療效及預(yù)后的相關(guān)性研究[D];浙江大學(xué);2008年

8 漆勇;血漿凝溶膠蛋白在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的作用研究[D];浙江大學(xué);2008年

9 王佳;凝溶膠蛋白在急性放射損傷防護中的作用[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

10 陳文靜;Gelsolin在小鼠肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用及其機制的研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2010年

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉弈巖;趙杰;程龍霄;唐月華;馮佑民;;小型類胰島素生長因子-1的制備及其體外解折疊的初步研究[J];浙江理工大學(xué)學(xué)報;2009年05期

2 楊斌盛;名潔;宋珍;;蛋白質(zhì)多態(tài)解折疊行為與穩(wěn)定性Ⅱ:酶的多態(tài)解折疊行為[J];中國科學(xué):化學(xué);2014年04期

3 郝世富;抓住“變”與“不變”是解折疊圖問題的關(guān)鍵[J];數(shù)學(xué)通訊;2001年06期

4 王賢樹,童俊超,韓學(xué)海,楊福愉;脫血紅素細(xì)胞色素c的解折疊狀態(tài)與跨膜運送能力的相關(guān)性[J];中國科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1994年01期

5 郭占云,喬志松,馮佑民;重組單鏈胰島素在含有巰基試劑的變性劑中的解折疊[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報;2001年04期

6 柳樹群,劉次全;翻譯過程中mRNA的拓?fù)湫螒B(tài)及其鏈構(gòu)象分析[J];科學(xué)通報;2002年01期

7 傅毅;吳小俊;;Barnase早期熱變性位點的動力學(xué)模擬研究[J];計算機與應(yīng)用化學(xué);2013年11期

8 劉次全;;mRNA解折疊的鏈構(gòu)象與相應(yīng)新生肽鏈構(gòu)象相關(guān)性的探索[J];自然雜志;2006年01期

9 楊福愉;蛋白質(zhì)跨膜運送研究的新進(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1991年02期

10 童俊超，楊福愉;不同解折疊狀態(tài)雞心脫血紅素細(xì)胞色素c分子的表面性質(zhì)[J];生物物理學(xué)報;1994年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 丁延偉;白玉霞;張廣照;;微量差示掃描量熱法研究溶菌酶在擁擠環(huán)境下的熱致解折疊和重復(fù)解折疊行為[A];中國化學(xué)會成立80周年第十六屆全國化學(xué)熱力學(xué)和熱分析學(xué)術(shù)會議論文集[C];2012年

2 趙杰;黃啟龍;唐月華;邵素清;許根俊;馮佑民;;單鏈豬的胰島素原的平衡折疊-用一種簡單方法來研究含二硫鍵蛋白質(zhì)的體外折疊／解折疊[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會2006年學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2006年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 譚翠燕;蛋白質(zhì)折疊/解折疊研究[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2007年

2 羅俊杰;蛋白質(zhì)解折疊及其影響磷脂膜結(jié)構(gòu)與相行為的機理研究[D];清華大學(xué);2013年

3 高翔;基于原子力顯微鏡的單分子力譜對蛋白質(zhì)的研究[D];南京大學(xué);2015年

4 傅毅;分子模擬及其在生物工程上的應(yīng)用[D];江南大學(xué);2010年

5 孟偉;化學(xué)修飾和滲透劑影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和折疊動力學(xué)的研究[D];南京大學(xué);2013年

6 呂春梅;利用單分子力譜研究凝溶膠蛋白的力學(xué)性質(zhì)[D];南京大學(xué);2013年

7 成博;幾種典型生物高分子與水相互作用的單分子研究[D];西南交通大學(xué);2015年

8 喬志松;胰島素受體配基結(jié)合結(jié)構(gòu)域L1和L2的表達(dá)與鑒定及胰島素原的折疊與解折疊[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2002年

9 劉洪林;同步輻射圓二色光譜學(xué)研究生物大分子結(jié)構(gòu)與功能[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2010年

10 陳衍;胰島素家族成員折疊行為研究[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2004年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 江建冰;膠原模型肽的分子標(biāo)記與其三螺旋的折疊/解折疊研究[D];蘭州大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：基于原子力顯微鏡的單分子力譜對蛋白質(zhì)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：214930