【摘要】：目的:RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種細(xì)胞在進化過程中保留的在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行沉默或抑制的調(diào)控方式。RNAi作用廣泛存在于真核細(xì)胞中。在真核細(xì)胞中,RNAi過程主要由小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)和微小RNA(microRNA,mi RNA)介導(dǎo)完成。siRNA或miRNA識別并結(jié)合Argonaute 2(Ago2)蛋白后形成RNAi的效應(yīng)器—RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC介導(dǎo)siRNA或miRNA對于靶mRNA的識別及切割,在RNAi過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。因此RISC的核心組分Ago2蛋白被稱為RNAi裝置的催化引擎。因此對于核心分子Ago2的調(diào)控研究有助于深入了解RNAi的作用過程。本實驗室前期工作中,通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出了Ago2的相互作用蛋白26S蛋白酶體ATP酶亞基3(PSMC3)和RBBP6。并證實了PSMC3可以通過泛素化-蛋白酶體途徑依賴的方式調(diào)節(jié)Ago2蛋白的穩(wěn)定性,然而具體的分子機制尚不明確。本課題擬從泛素化角度展開PSMC3和RBBP6蛋白對Ago2蛋白的穩(wěn)定性調(diào)控機制的研究。方法:首先,我們利用溶酶體及蛋白酶體抑制劑處理細(xì)胞,檢測Ago2蛋白水平及泛素化水平的變化。然后,通過檢索BioGRID數(shù)據(jù)庫選定PSMC3可能的相互作用分子USP14為候選研究對象。其后,我們通過免疫共沉淀實驗、免疫熒光結(jié)合共聚焦顯微鏡采集圖像分析、放線菌酮實驗、Western blot及免疫沉淀等實驗驗證了PSMC3為USP14的相互作用蛋白并且Ago2是USP14的作用底物且USP14可以調(diào)控Ago2的泛素化水平。隨后,通過構(gòu)建USP14的不同突變體并結(jié)合免疫共沉淀分析確定了USP14與Ago2及PSMC3相互作用的結(jié)構(gòu)域;通過Western blot實驗確定了PSMC3對于Ago2的穩(wěn)定作用依賴于USP14。同時,我們通過免疫共沉淀實驗初步驗證了RBBP6與Ago2蛋白的相互作用,并通過Western blot實驗確定了RBBP6可以促進Ago2蛋白的泛素化并增強Ago2的降解。最后,通過Western blot實驗確定了RBBP6,PSMC3及USP14對于RNAi作用的影響。結(jié)果:蛋白酶體抑制劑可以促進泛素化的Ago2蛋白在體內(nèi)的累積。USP14可以分別與PSMC3及Ago2相互作用。干擾USP14可以明顯縮短Ago2蛋白的半衰期。USP14特異性抑制劑能夠促進泛素化的Ago2在細(xì)胞內(nèi)累積。USP14可以調(diào)控Ago2蛋白的水平且MG132使得此調(diào)控作用消失。確定了USP14分別與PSMC3及Ago2相互作用的最小結(jié)構(gòu)域。RBBP6與Ago2相互作用。RBBP6可以調(diào)控Ago2蛋白的水平且MG132使得此調(diào)控作用消失。RBBP6,PSMC3及USP14表達水平的改變可以影響RNAi的干擾效率。結(jié)論:本研究揭示了Ago2蛋白泛素化及去泛素化的調(diào)控過程。確定了USP14對于Ago2的去泛素化調(diào)控并抑制其隨后在26S蛋白酶體中的降解,并且證明PSMC3可以促進此調(diào)控過程。同時初步確定了RBBP6促進Ago2泛素化的作用。
[Abstract]:Objective: RNA interference (RNA interference) is a kind of regulation of gene expression silencing or inhibition at post-transcriptional level reserved by cells during evolution. RNAi is widely used in eukaryotic cells. In eukaryotic cells, the RNAi process is mainly mediated by small interfering RNAs (small interfering RNAs siRNAs) and microRNAs (microRNAs miRNAmiRNAs) mediated by. SiRNAs or miRNAs are recognized and combined with Argonaute 2 (Ago2) proteins to form RNAi effectors-RNA-induced silencing complexRISC .RISC mediated siRNAs or miRNAs to recognize and dissect target RNAs. It plays an important role in the RNAi process. Therefore, the core component of RISC Ago2 protein is called the catalytic engine of RNAi device. Therefore, the study on the regulation of the core molecule Ago2 is helpful to further understand the process of RNAi action. The interacting protein 26S proteasome ATPase subunit 3 (PSMC3) and RBBP6 of Ago2 were screened by yeast two-hybrid system. It is confirmed that PSMC3 can regulate the stability of Ago2 protein by Ubiquitin proteasome pathway dependent manner, but the specific molecular mechanism is not clear. The aim of this study was to investigate the mechanism of stability regulation of PSMC3 and RBBP6 proteins on Ago2 proteins from the perspective of ubiquitization. Methods: firstly, we treated cells with lysosome and proteasome inhibitors to detect the changes of Ago2 protein and ubiquitin level. Then, the possible interaction molecule USP14 of PSMC3 was selected as candidate by searching BioGRID database. Then, through the co-immunoprecipitation experiment, the immunofluorescence and confocal microscope were used to collect and analyze the image. Western blot and immunoprecipitation experiments confirmed that PSMC3 is the interacting protein of USP14 and Ago2 is the substrate of USP14, and USP14 can regulate the level of ubiquitin of Ago2. Then, the domain of interaction of USP14 with Ago2 and PSMC3 was determined by constructing different mutants of USP14 and combining with immunoprecipitation analysis, and the stability of PSMC3 to Ago2 was determined by Western blot experiment. At the same time, the interaction between RBBP6 and Ago2 protein was preliminarily verified by immunoprecipitation, and it was confirmed by Western blot that RBBP6 could promote the ubiquification of Ago2 protein and enhance the degradation of Ago2. Finally, the effects of RBBP6 PSMC3 and USP14 on RNAi were determined by Western blot. Results: proteasome inhibitor could promote the accumulation of ubiquitin Ago2 protein in vivo. USP14 could interact with PSMC3 and Ago2 respectively. Interfering with USP14 could significantly shorten the half-life of Ago2 protein. USP14-specific inhibitor could promote the accumulation of ubiquitin Ago2 in cells. USP14 could regulate the level of Ago2 protein and MG132 could make this regulation disappear. It was determined that the minimal domain of USP14 interacting with PSMC3 and Ago2. RBBP6 interacting with Ago2 could regulate the level of Ago2 protein, and MG132 could make this regulation disappear. The change of expression level of PSMC3 and USP14 could affect the interference efficiency of Ago2. Conclusion: this study revealed the regulatory process of Ago2 ubiquitization and deubiquification. The regulation of USP14 on the deubiquification of Ago2 and its subsequent degradation in 26s proteasome were determined, and PSMC3 was proved to facilitate this process. At the same time, the role of RBBP6 in promoting the ubiquitin of Ago2 was preliminarily confirmed.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q75

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本文編號：2130987