本文關(guān)鍵詞：特異性定點(diǎn)共價(jià)固定化及�；尼尫琶窼T0779的非特異性催化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林大學(xué)》 2015年

特異性定點(diǎn)共價(jià)固定化及�；尼尫琶窼T0779的非特異性催化的研究

李蓉  

【摘要】：酶作為高效的生物催化劑在化工、食品、醫(yī)藥、環(huán)境治理和檢測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。但是酶制劑存在著活性不穩(wěn)定、回收利用率差，容易受到外界因素如溫度、pH值等的影響而失活等問(wèn)題而使其應(yīng)用受到了許多限制。酶固定化技術(shù)可以克服酶制劑在應(yīng)用中穩(wěn)定性差、重復(fù)利用率低等問(wèn)題，因此越來(lái)越受到重視。 目前酶的固定化方法可分為非特異性固定化和特異性固定化。其中特異性固定化是通過(guò)對(duì)酶進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)和改造向酶蛋白中引進(jìn)一些特殊的功能團(tuán)，利用這些功能團(tuán)可以使酶與載體進(jìn)行特異性定點(diǎn)結(jié)合。此方法因可以針對(duì)性地提高酶活性、穩(wěn)定性或增強(qiáng)催化特異性而成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。 本文采用特異性定點(diǎn)共價(jià)固定化方法進(jìn)行研究。通過(guò)對(duì)酶進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)和改造，向酶蛋白中引入特異性反應(yīng)功能團(tuán)——醛基，并利用此功能團(tuán)定點(diǎn)與氨基載體進(jìn)行共價(jià)固定化。此方法不僅可以通過(guò)合理地設(shè)計(jì)與選擇對(duì)進(jìn)行酶有針對(duì)性的固定化，同時(shí)形成的共價(jià)鍵使酶與載體之間的固定更加牢固，不易脫落。我們利用甲酰甘氨酸生成酶（FGE）能夠識(shí)別硫酸酯酶序列中高度保守序列LCXPXR，并可以催化其中的半胱氨酸轉(zhuǎn)化成含有一個(gè)醛基的甲酰甘氨酸（FGly）的特性。將這六個(gè)保守序列通過(guò)基因工程引入目標(biāo)酶的蛋白氨基酸中，使目標(biāo)蛋白經(jīng)FGE的催化修飾帶有特異性的醛基功能團(tuán)，從而獲得含有醛基標(biāo)簽的重組酶蛋白。以商用質(zhì)粒載體pET-28a為改造骨架，將其用于純化表達(dá)的組氨酸標(biāo)簽（組氨酸標(biāo)簽）替換為醛基標(biāo)簽（醛基標(biāo)簽），成為具有通用性的可以用于構(gòu)建含有特異性醛基標(biāo)簽的重組蛋白表達(dá)載體。并且利用質(zhì)粒載體pET-28a在位于多克隆位點(diǎn)的N、C端分別含有一個(gè)組氨酸標(biāo)簽的特點(diǎn)，我們構(gòu)建了四個(gè)表達(dá)載體亞型：無(wú)組氨酸標(biāo)簽的pET-28aDH、N端含有醛基標(biāo)簽的pET-28aNQ、C端含有醛基標(biāo)簽的pET-28aCQ以及兩端均含有醛基標(biāo)簽的pET-28aDQ。之后選用了4個(gè)不同來(lái)源的酶作為模式酶來(lái)構(gòu)建含有醛基標(biāo)簽的酶，分別為嗜熱酰基肽釋放酶ST0779、嗜熱酯酶APE1547、嗜熱脫氯酶ST2570以及脂肪酶LipA，并對(duì)不同位置引入醛基標(biāo)簽對(duì)酶蛋白的表達(dá)和酶活的影響進(jìn)行了系統(tǒng)研究。研究結(jié)果在蛋白的N、C端分別引起醛基標(biāo)簽，其目的蛋白表達(dá)量及酶活力均受到不同程度的影響；而兩端同時(shí)引入醛基標(biāo)簽，對(duì)蛋白的表達(dá)及酶活力都出現(xiàn)大幅度下降。同時(shí)對(duì)修飾后的酶進(jìn)行了固定化研究，測(cè)定酶固定化效率、穩(wěn)定性以及回收利用率。結(jié)果顯示，固定化的穩(wěn)定化有所提高，固定化過(guò)程中有針對(duì)性無(wú)醛基標(biāo)簽蛋白不能固定于載體上。 一直以來(lái)酶都被認(rèn)為是具有專一性、特異性，只對(duì)一類反應(yīng)具有高度識(shí)別性的生物催化劑，但是最近一些研究發(fā)現(xiàn)一些酶能夠利用主反應(yīng)的活性位點(diǎn)催化不同于其主要酶活性反應(yīng)，即為酶的催化非特異性。此特性不僅拓展了酶促有機(jī)合成的反應(yīng)類型，提高了酶在有機(jī)合成領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也對(duì)研究不同酶的進(jìn)化關(guān)系提供重要的線索。其中研究最為廣泛的是來(lái)自/β水解酶家族一類絲氨酸水解酶，可催化C-C和C-N鍵形成的反應(yīng)。嗜熱�；尼尫琶窼T0779屬于/β水解酶家族，其催化三聯(lián)體與脂肪酶的催化三聯(lián)體相一致，我們推測(cè)其也可能具有酶的催化非特異性特性。本論文首次嘗試研究并發(fā)現(xiàn)ST0779可以進(jìn)行非特異性催化aldol反應(yīng)。脂肪酶PPL是目前研究報(bào)道中非特異性催化aldol反應(yīng)效果最好的酶。因此我們用脂肪酶PPL作為對(duì)照來(lái)比較反應(yīng)速率、產(chǎn)率以及產(chǎn)物的立體選擇性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以4-對(duì)硝基苯甲醛和丙酮為底物，在55℃下ST0779催化4h即可達(dá)到96.1%的轉(zhuǎn)化率。而PPL在30℃催化48h才達(dá)到39.2%的轉(zhuǎn)化率，ST0779的非特異性催化aldol反應(yīng)效率要高于目前已報(bào)道過(guò)的酶非特異性催化aldol反應(yīng)效率。 為了更好的理解ST0779和PPL非特異性催化aldol反應(yīng)機(jī)理，我們通過(guò)熒光光譜來(lái)研究底物分子丙酮、對(duì)硝基苯甲醛與酶分子之間相互作用。通過(guò)分析得到底物與蛋白的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)以及結(jié)合力類型，結(jié)合酶分子結(jié)構(gòu)來(lái)解釋ST0779非特異性催化aldol反應(yīng)的機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q814.2
【目錄】：

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本文編號(hào)：209037