本文選題：轉(zhuǎn)錄激活 + Xyr1　； 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：纖維素是由葡萄糖單元通過β-(1,4)糖苷鍵聚合而成的大分子多糖,是植物和藻類利用光能和二氧化碳進(jìn)行光合作用的產(chǎn)物。作為植物細(xì)胞壁的主要組份,纖維素是地球上含量最豐富的碳水化合物之一。因此,其生物降解不僅構(gòu)成了自然界碳循環(huán)的重要環(huán)節(jié),而且也是生物質(zhì)燃料及大宗生物基產(chǎn)品生產(chǎn)的重要原料。在自然界中存在著眾多具有纖維素降解能力的微生物,絲狀真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是其中的杰出代表。里氏木霉是一種十分高效的纖維素降解真菌,在纖維素存在的條件下,能迅速做出響應(yīng)誘導(dǎo)表達(dá)大量的纖維素酶基因,以實(shí)現(xiàn)對纖維素的高效降解。由于其具備強(qiáng)大的纖維素酶表達(dá)能力,因此被開發(fā)為重要的纖維素酶工業(yè)生產(chǎn)菌株,在生物能源生產(chǎn)領(lǐng)域具有十分重要的價(jià)值和地位。雖然經(jīng)過數(shù)十年的誘變育種和研究,已經(jīng)獲得了多個(gè)里氏木霉纖維素酶高產(chǎn)菌株,其產(chǎn)酶性能也得到了極大的提高。但是目前纖維素酶的高成本依然是制約生物能源及大宗生物基產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)的一個(gè)瓶頸。因此進(jìn)一步提升里氏木霉纖維素酶的表達(dá)水平和水解效率是解決該問題的根本。經(jīng)過幾十年的研究,人們對里氏木霉纖維素酶系的組成、理化性質(zhì)、水解纖維素的作用機(jī)制等均有了較為深入的研究和認(rèn)識(shí),并且在里氏木霉中也鑒定了多個(gè)參與纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子,其中包括轉(zhuǎn)錄激活因子Xyr1。雖然遺傳學(xué)分析表明Xyr1控制著幾乎所有的纖維素酶基因和半纖維素酶基因的誘導(dǎo)表達(dá),但Xyr1如何激活纖維素酶基因表達(dá)的具體作用機(jī)制目前尚不清楚。因此,對Xyr1作用機(jī)制的深入研究不僅能夠使我們更深入地了解里氏木霉纖維素酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控機(jī)制,而且可以為里氏木霉菌株的遺傳改良和進(jìn)一步提高纖維素酶工業(yè)生產(chǎn)水平提供理論支持。本論文的研究工作圍繞Xyr1如何啟動(dòng)纖維素酶基因表達(dá)這一問題展開,以Xyr1相互作用蛋白為切入點(diǎn),同時(shí)對可能參與Xyr1轉(zhuǎn)錄激活過程的兩個(gè)復(fù)合物的重要亞基的功能進(jìn)行了深入研究。主要研究結(jié)果如下:1.通過酵母雙雜交篩選,鑒定了一個(gè)新的Xyr1相互作用蛋白MATa1。對其功能研究發(fā)現(xiàn),MATa1參與光照下的纖維素酶基因誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控,并且以依賴Xyr1的方式被募集至纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū)參與Xyr1對纖維素酶基因表達(dá)的調(diào)控。為了鑒定參與Xyr1調(diào)控纖維素酶基因表達(dá)過程的輔因子,我們構(gòu)建了里氏木霉cDNA表達(dá)文庫,并通過酵母雙雜交篩選獲得了一個(gè)注釋為接合型座位轉(zhuǎn)錄因子(mating tpye locus transcription factor)MATa1。細(xì)胞定位分析表明,MATa1和Xyr1共定位于細(xì)胞核中。通過構(gòu)建mata1基因敲除菌并分析其纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),MATa1缺失會(huì)降低光照條件下纖維素酶的誘導(dǎo)表達(dá)水平,而在黑暗條件下則幾乎不影響纖維素酶的表達(dá)。與敲除菌株表型相反,MATa1過表達(dá)菌株中的纖維素酶誘導(dǎo)受到明顯的抑制,暗示過高的胞內(nèi)MATa1水平可能會(huì)干擾Xyr1的功能。通過染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)分析發(fā)現(xiàn),MATa1只有在纖維素誘導(dǎo)條件下才可結(jié)合到纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū),而其對信息素前體基因hpp1和信息素受體基因hpr2啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合則不受碳源的影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在Xyr1缺失背景下,MATa1無法結(jié)合纖維素酶基因啟動(dòng)子,表明MATa1在誘導(dǎo)下與纖維素酶基因啟動(dòng)子的結(jié)合依賴于轉(zhuǎn)錄因子Xyr1。綜上所述,我們通過篩選相互作用蛋白的方法并結(jié)合體內(nèi)功能研究鑒定了一個(gè)Xyr1相互作用蛋白MATa1,并發(fā)現(xiàn)其以Xyr1依賴的方式被招募至纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū)參與纖維素酶基因誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控。2.發(fā)現(xiàn)里氏木霉乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物GCN5/ADA2/ADA3在纖維素酶基因誘導(dǎo)表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用。真核生物中,組蛋白乙酰化修飾通常與基因的轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)。本課題組前期鑒了里氏木霉乙酰轉(zhuǎn)移酶GCN5并發(fā)現(xiàn)其對于纖維素酶基因誘導(dǎo)表達(dá)十分關(guān)鍵。然而GCN5的缺失會(huì)對菌體造成很大的影響,如嚴(yán)重影響生長、生孢等基本生命活動(dòng),也不便于后續(xù)遺傳操作和菌種保藏。為了解決這一問題,本研究構(gòu)建了一個(gè)基于銅離子響應(yīng)、可控表達(dá)的啟動(dòng)子置換系統(tǒng),即通過一步同源雙交換的方法將目的基因的啟動(dòng)子置換為銅離子響應(yīng)的tcu1啟動(dòng)子,通過外源添加銅離子來實(shí)現(xiàn)對目的基因表達(dá)的控制。通過構(gòu)建GCN5的啟動(dòng)子置換菌株并進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),加入銅離子關(guān)閉表達(dá)呈現(xiàn)與缺失菌一樣的表型,這表明該系統(tǒng)是成功的。我們進(jìn)一步通過生物信息學(xué)的方法鑒定了乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的另外兩個(gè)亞基,Ada2和Ada3,并利用該系統(tǒng)對兩者的功能進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),關(guān)閉Ada2的表達(dá)導(dǎo)致纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)受到十分嚴(yán)重的影響,說明Ada2在纖維素酶基因表達(dá)過程中發(fā)揮十分重要的作用。同樣地,關(guān)閉Ada3的表達(dá)對生長造成較大影響,同時(shí)也導(dǎo)致纖維素酶表達(dá)水平明顯下調(diào)。綜上所述,GCN5/Ada2/Ada3乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物參與里氏木霉生長、生孢和纖維素酶表達(dá)等生理學(xué)過程并在其中發(fā)揮著十分重要的作用。3.Xyr1通過靶向募集組蛋白乙釀轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物至纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控纖維素酶基因表達(dá)。通過ChIP分析發(fā)現(xiàn),在纖維素誘導(dǎo)下,纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū)的H3K9、H3K14乙�；揎椡瑫r(shí)依賴于GCN5和Xyr1,暗示兩者在功能上存在一定程度的關(guān)聯(lián)。通過酵母雙雜交分析發(fā)現(xiàn)Xyr1與GCN5和Ada3存在相互作用。通過構(gòu)建ProA-GCN5重組菌株并進(jìn)行ChIP分析發(fā)現(xiàn),在纖維素誘導(dǎo)下,GCN5能被招募至纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在Xyr1過表達(dá)背景下,即使在非誘導(dǎo)條件,GCN5也能被招募至纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū)。由此可見Xyr1很可能通過靶向募集GCN5/Ada2/Ada3乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物來介導(dǎo)纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行乙�；揎棿龠M(jìn)纖維素酶基因的表達(dá)。然而對OExyr1_Ptcu1-gcn5菌株的表型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),在Xyr1過表達(dá)條件下,無論在誘導(dǎo)下還是非誘導(dǎo)下,關(guān)閉GCN5的表達(dá)并不影響纖維素酶基因的表達(dá)。由此可見,當(dāng)Xyr1過量表達(dá)的情況下,可以擺脫對GCN5的依賴。綜上所述,在里氏木霉纖維素酶基因誘導(dǎo)表達(dá)過程中,GCN5一方面調(diào)控Xyr1的表達(dá),另一方面在纖維素誘導(dǎo)下,表達(dá)出來的Xyr1會(huì)招募GCN5復(fù)合物對纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行乙�；揎�,進(jìn)一步促進(jìn)纖維素酶基因的表達(dá)。因此,Xyr1表達(dá)水平的調(diào)控是纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的一個(gè)重要開關(guān)。4.發(fā)現(xiàn)里氏木霉Mediator復(fù)合物Gal11亞基差異調(diào)控纖維素酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)。在真核生物基因表達(dá)過程中,Mediator復(fù)合物在基因的轉(zhuǎn)錄激活過程中發(fā)揮著十分重要的作用,其中尾部模塊(Tail module)的Gal11是很多轉(zhuǎn)錄激活激活因子結(jié)合的靶標(biāo)。我們通過生物信息學(xué)方法鑒定了里氏木霉Mediator復(fù)合物亞基的Gal11亞基。通過構(gòu)建gal11缺失突變體并對其表型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),Gal11缺失并不影響菌體在固體和液體培養(yǎng)基中的生長和對多種碳源的利用,但是Gal11缺失突變株基本不產(chǎn)生分生孢子,并且不再產(chǎn)生色素,表明Gal11對于有性生殖和次級(jí)代謝具有非常重要的調(diào)控作用。對纖維素誘導(dǎo)下的突變體表型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),Gal11缺失導(dǎo)致胞外的內(nèi)切纖維素酶和外切纖維素酶酶活均大幅度降低,但β-葡萄糖苷酶基因的表達(dá)并不受Gal11缺失的影響。進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果表明,上述差異調(diào)控現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,并且Gal11缺失會(huì)導(dǎo)致xyr1的轉(zhuǎn)錄水平急劇降低。綜合上述研究,我們發(fā)現(xiàn)里氏木霉Gal11在分生孢子形成、次級(jí)代謝過程發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用,并且差異調(diào)控纖維素酶基因的誘導(dǎo)表達(dá),其對外切纖維素酶和內(nèi)切纖維素酶基因的充分誘導(dǎo)表達(dá)是必須的,但不參與β-葡萄糖苷酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)。5.Gal11通過參與對RNA聚合酶 Ⅱ的募集和影響Xyr1的穩(wěn)定性來調(diào)控纖維素酶基因表達(dá)。通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)對Gal11缺失菌中纖維素酶基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)的相關(guān)因子的募集分析發(fā)現(xiàn),Gal11的缺失導(dǎo)致外切纖維素酶基因和內(nèi)切纖維素酶基因核心啟動(dòng)子區(qū)RNA聚合酶Ⅱ的募集水平急劇降低,然而β-葡萄糖苷酶基因核心啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合水平則不受影響。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),Gal11缺失后,雖然xyr1轉(zhuǎn)錄水平顯著降低,但纖維素酶啟動(dòng)子區(qū)的Xyr1結(jié)合水平反而高于對照菌株,由此可見Gal11缺失導(dǎo)致結(jié)合于啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)的Xyr1更加穩(wěn)定。在Xyr1過表達(dá)菌株中缺失Gal11并分析其表型發(fā)現(xiàn),Xyr1的過表達(dá)并不能恢復(fù)Gal11缺失造成的纖維素酶下調(diào)效應(yīng)。對該菌株在非誘導(dǎo)條件下的表型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),Xyr1過表達(dá)菌株在缺失Gal11后在葡萄糖培養(yǎng)基中同樣幾乎無法啟動(dòng)纖維素酶基因的表達(dá)。ChIP分析發(fā)現(xiàn),在此條件下,該菌株中Xyr1在纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合水平也要高于出發(fā)菌株OExyr1,而RNA聚合酶Ⅱ的募集水平卻急劇降低。由此可見,Gal11對于過表達(dá)Xyr1菌株在非誘導(dǎo)下高水平激活纖維素酶基因表達(dá)是必須的。綜合上述結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn),Gal11在里氏木霉纖維素酶基因的完全誘導(dǎo)表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用,這種作用很大程度上是通過影響RNA PolⅡ的募集來實(shí)現(xiàn)的,并且Gal1對Xyr1在啟動(dòng)子上的結(jié)合水平具有重要的調(diào)控作用,在過表達(dá)Xyr1所介導(dǎo)的非誘導(dǎo)條件下纖維素酶基因的高水平表達(dá)是必須的。6.過表達(dá)Xyr1導(dǎo)致纖維素酶基因非誘導(dǎo)依賴的差異化表達(dá)。通過轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Xyr1在非誘導(dǎo)條件下可激活絕大多數(shù)的纖維素酶和半纖維素酶基因的表達(dá),同時(shí)也造成占全基因組約40%基因的表達(dá)下調(diào),其中包括很多基礎(chǔ)代謝途徑的基因。我們之前研究發(fā)現(xiàn),在里氏木霉中過表達(dá)Xyr1會(huì)造成纖維素酶組成型高水平表達(dá)。本研究在里氏木霉QM9414Axyr1菌株中構(gòu)建了定點(diǎn)過表達(dá)Xyr1的菌株(OExyr1)。該菌株在葡萄糖培養(yǎng)基中的纖維素酶表達(dá)速率和總酶活水平均要高于QM9414在誘導(dǎo)下的水平。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),相比較于內(nèi)切纖維素酶和外切纖維素酶的表達(dá),過表達(dá)Xyr1對β-葡萄糖苷酶的激活作用較弱,要顯著低于QM9414在誘導(dǎo)條件下的水平。通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),在非誘導(dǎo)條件下,過表達(dá)Xyr1會(huì)導(dǎo)致纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū)的核小體占據(jù)水平急劇降低,這種核小體丟失的現(xiàn)象在野生型纖維素酶基因誘導(dǎo)表達(dá)過程中也同樣存在。關(guān)閉Xyr1表達(dá)后則又能恢復(fù)到野生型的水平。這一結(jié)果表明Xyr1在激活纖維素酶基因表達(dá)過程中的伴隨的一個(gè)重要事件便是對核小體進(jìn)行重排和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控使之變得更為開放。為了進(jìn)一步分析過表達(dá)Xyr1對整個(gè)基因組基因表達(dá)譜式的影響,我們對該菌株在葡萄糖條件下以及QM9414對照菌株在纖維素誘導(dǎo)與葡萄糖非誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄本樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)分析。結(jié)果表明,在葡萄糖培養(yǎng)條件下,Xyr1過表達(dá)菌株下相比QM9414有589個(gè)基因表達(dá)上調(diào),3637個(gè)基因表達(dá)下調(diào);在纖維素誘導(dǎo)條件下,QM9414分別有897和1012個(gè)基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)。進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn),兩個(gè)菌株中有334個(gè)基因上調(diào)基因重疊,其中包括絕大多數(shù)的纖維素酶基因和半纖維素酶基因,而參與誘導(dǎo)下纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子包括Ace2、Ace3、Clr1、Clr2等,在Xyr1過表達(dá)菌株中幾乎均未呈現(xiàn)出表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象。由此可見,單獨(dú)過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Xyr1可能便足以啟動(dòng)纖維素酶系基因和半纖維素酶系基因的表達(dá)。在QM9414菌株中大多數(shù)纖維素誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在OExyrl菌株中均未呈現(xiàn)上調(diào)趨勢,包括對纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)所必須的一個(gè)主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)超家族(major facilitator superfamily,MFS)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Crt1,這表明Xyr1的過表達(dá)可以在某種程度上繞過上游的碳源感應(yīng)和傳導(dǎo)信號(hào)途徑啟動(dòng)纖維素酶表達(dá)。在蛋白折疊分泌途徑中發(fā)揮重要作用的一些基因如Bip1、Pdi1/2/3、Cne1等,在OExyr1菌株中的表達(dá)水平發(fā)生明顯上調(diào),并且要高于QM9414在誘導(dǎo)下的水平,可見Xyr1的過表達(dá)也促進(jìn)了菌體對纖維素酶的折疊分泌。綜合上述轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知,在里氏木霉中單獨(dú)過表達(dá)Xyr1在很大程度上擺脫了野生型中纖維素酶基因誘導(dǎo)表達(dá)過程中對上游誘導(dǎo)碳源轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)傳導(dǎo)以及對其他轉(zhuǎn)錄因子作用的依賴,并且一定程度上促進(jìn)了蛋白折疊分泌途徑相關(guān)蛋白的表達(dá),使該菌株適應(yīng)持續(xù)高水平表達(dá)的纖維素酶基因并將胞內(nèi)大量合成的纖維素酶分泌至胞外。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78
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本文編號(hào)：2070981