發(fā)布時間：2018-06-21 23:34

  本文選題：核酸檢測 + 微流控　； 參考：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：具有高度多樣性與特異性的核酸分子作為生物標志物能對不同種類生物物種、個體乃至單個基因進行識別與檢測。2006年Nature雜志撰文提出了由世界衛(wèi)生組織制定的滿足發(fā)展中地區(qū)傳染疾病診斷需求的ASSURED標準。依據(jù)此標準,近年來人們致力于解決核酸檢測過程中的各項技術(shù)難點,簡化操作步驟,提高檢測性能與效率以及降低用戶使用難度,使之滿足現(xiàn)場即時檢測的各項挑戰(zhàn)。為解決現(xiàn)有核酸定性與定量檢測方法中存在的不足與問題,尤其針對現(xiàn)場即時診斷應(yīng)用中的局限,本文結(jié)合微流控技術(shù)與核酸等溫擴增技術(shù),研究了基于旋轉(zhuǎn)反應(yīng)芯片與離心式數(shù)字擴增芯片的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增核酸定性與定量可視化檢測方法,將有可能為疾病診斷、生化分析、環(huán)境監(jiān)測、法醫(yī)鑒定以及食品安全等各個領(lǐng)域提供新型核酸分析技術(shù)平臺。首先,建立了一種半封閉式的微流控旋轉(zhuǎn)反應(yīng)芯片平臺,并將其成功應(yīng)用于可視化環(huán)介導(dǎo)核酸等溫擴增檢測中。通過對芯片玻璃表面進行疏水修飾,實現(xiàn)了多種液樣的載入與平行混合反應(yīng),避免了漏液以及交叉污染,并以熒光淬滅混合反應(yīng)進行了方法驗證與評價,成功表征了跨越近3個濃度數(shù)量級的熒光反應(yīng)。自制了基于帕爾貼熱電半導(dǎo)體的專用小型加熱系統(tǒng)用以對芯片等溫擴增進行溫度快速控制與維持,可使芯片內(nèi)樣品5min之內(nèi)達到反應(yīng)溫度。通過測試銅離子、納米銀以及pH條件對熒光指示劑淬滅效率的影響,優(yōu)化及實現(xiàn)了可視化芯片等溫擴增檢測方法并達到了4～5倍的陽性/陰性熒光強度比,同時單孔反應(yīng)試劑消耗體積降低至0.7μL。最后,系統(tǒng)探討了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測中的產(chǎn)物污染管控問題,并確定了可消除檢測假陽性的體系設(shè)置與操作模式。其次,在已建立的可視化芯片等溫擴增檢測方法基礎(chǔ)上,針對包括蠟樣芽胞桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、河流弧菌以及副溶血弧菌在內(nèi)的五種消化道常見病原菌進行了定性檢測研究。通過對包含內(nèi)引物、脫氧核糖核苷三磷酸、嗜熱脂肪芽孢桿菌核酸聚合酶、甜菜堿及鎂離子在內(nèi)的擴增體系主要成分進行芯片濃度優(yōu)化擴增測試,確定了各組分最優(yōu)化工作濃度。在這一反應(yīng)條件下成功地實現(xiàn)了對河流弧菌的可視化芯片檢測,獲得了約7.2copies/μL的檢測極限,同時驗證了自行設(shè)計引物的良好特異性。最后,成功實現(xiàn)了多病原體的芯片可視化同步檢測并且與芯片外常規(guī)等溫擴增結(jié)果進行了對照,取得了不錯的一致性。隨后,基于泊松統(tǒng)計以及化學(xué)計量學(xué)基本理論,建立了數(shù)字等溫擴增定量檢測方法的數(shù)學(xué)模型,利用科學(xué)計算與可視化工具對該模型進行了蒙特卡洛模擬分析并驗證了極大似然估計計算方法的有效性與可靠性。分別計算了擴增元數(shù)為1200與12000時數(shù)字定量方法的精度,準度與動態(tài)范圍等技術(shù)參數(shù),并基于理論計算將其與基于Ct值的實時定量方法進行了優(yōu)劣比較并分析了兩者的定量分辨率。最后,本文特別設(shè)計研制了用于核酸絕對定量檢測的離心式數(shù)字擴增芯片并對樣品離散化方式,溫度控制以及防蒸發(fā)效果進行了測試與驗證。該芯片擴增元體積及光強分布較為平均,變異系數(shù)分別為2.27%與0.676%,且完全能滿足肉眼或便攜光學(xué)傳感器的檢測需求,可有效降低核酸定量檢測分析成本。最后,結(jié)合離心式數(shù)字擴增芯片以及可視化等溫擴增方法對河流弧菌病原體載量進行測定。優(yōu)化了反應(yīng)溫度,反應(yīng)酶活,反應(yīng)時間等擴增反應(yīng)條件,并比較了不同成像條件對數(shù)字等溫擴增定量結(jié)果的影響。該芯片方法能有效的對跨越4個數(shù)量級濃度的病原菌基因組核酸進行定量分析,結(jié)果與實時熒光定量結(jié)果一致。相較于本文的定性方法,檢測極限進一步低至8.7×10-2copies/μL,檢測時間縮短至40min,并且單次檢測極具成本效益。通過結(jié)合定制的帕爾貼熱電半導(dǎo)體加熱器與便攜光學(xué)傳感器,該定量方法擺脫了對實時熒光檢測器或熱循環(huán)設(shè)備的依賴,滿足了現(xiàn)場即時診斷的應(yīng)用需求。
[Abstract]:A semi - closed microflow control rotary reaction chip platform is established , which can be used in the isothermal amplification of nucleic acid . The test and verification of the temperature control and the anti - evaporation effect are carried out . The amplification unit volume and the intensity distribution of the chip are average , the coefficient of variation is 2 . 27 % and 0 . 676 % respectively , and the effect of different imaging conditions on the quantitative result of digital isothermal amplification can be effectively reduced .
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q503;R440
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本文編號：2050521