本文選題：紫花苜蓿 + γ-生育酚甲基轉移酶　； 參考：《中國農(nóng)業(yè)科學院》2016年博士論文

【摘要】：紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)是異花授粉的同源四倍體且基因組龐大,復雜的遺傳背景限制了其有價值基因的發(fā)掘和利用。維生素E的合成途徑在多個物種中都進行了深入研究,然而關于紫花苜蓿維生素E的合成卻鮮有報道。為了提高紫花苜蓿的營養(yǎng)價值,優(yōu)化紫花苜蓿的維生素E含量和組分,本研究以紫花苜蓿中苜一號(Medicago Sativa L. vs Zhongmu No.l)為材料克隆得到維生素E合成途徑的γ-生育酚甲基轉移酶(y-TMT),尿黑酸植基轉移酶(HPT)和4-羥苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)并進行研究,取得如下進展：1.以紫花苜蓿葉片為實驗材料,采用cDNA末端快速擴增技術(RACE)克隆得到γ-生育酚甲基轉移酶(y-TMT)。進化樹分析結果表明,紫花苜蓿MsTMT與截形苜蓿MtTMT高度同源,說明我們成功從紫花苜蓿中克隆得到了y-TMT并將其命名為MsTMT.熒光定量PCR分析結果表明,該基因在整株植物中均有表達,其中葉片中表達量最高,花中表達量最低。NaCl、15%PEG、黑暗和脫落酸均可以誘導MsTMT的表達,而低溫則抑制MsTMT的表達。轉基因擬南芥種子中α-生育酚的含量顯著增加,葉片中維生素E的組分和含量則沒有變化。同時轉基因擬南芥內源維生素E合成基因的表達量均未受到影響。甘露醇處理條件下,轉基因擬南芥的發(fā)芽率,以及生物量顯著高于對照,CAT和POD活性在轉基因擬南芥中顯著提高,而且滲透脅迫的標志基因的表達量在轉基因擬南芥中顯著上調,說明轉基因擬南芥與對照相比抗逆性增強。轉基因紫花苜蓿葉片中α-生育酚和α-生育三烯酚含量以及粗蛋白的含量均有增加,并且在黑暗誘導條件下轉基因紫花苜蓿的衰老與對照相比有所延緩。說明MsTMT在不影響紫花苜蓿品質的同時還可以調控轉基因紫花苜蓿的葉片衰老過程,因此可以做為紫花苜蓿品質改良的候選基因。2.以紫花苜蓿葉片為實驗材料,采用cDNA末端快速擴增技術(RACE)克隆得到尿黑酸植基轉移酶(HPT)的cDNA序列,該基因有一個1236bp的完整開放閱讀框,編碼411個氨基酸,屬于異戊烯轉移酶UbiA家族,有異戊烯轉移酶HPT1保守結構域。多序列比對分析結果顯示,該蛋白與其他物種的HPT高度同源,蛋白序列相似度達80%,由此證明我們成功克隆得到紫花苜蓿HPT基因,并命名為MsHPT。通過染色體步移技術獲得1.9Kb啟動子序列,序列分析表明,紫花苜蓿MsHPT啟動子區(qū)域除含有大量的核心啟動子元件TATA和CAAT之外,還有脫落酸、乙烯、赤霉素、榮莉酸甲酯等激素反應元件以及大量的與光反應有關的作用元件。實時熒光定量PCR技術分析MsHPT在各組織中的相對表達量,結果表明,MsHPT基因在根、莖、葉中均有表達,葉片中表達量最高。15%PEG,NaCl,赤霉素和脫落酸均可一定程度上誘導該基因的表達。該基因對脅迫的廣泛響應,說明該基因可能在紫花苜�？鼓嫘陨暇哂幸欢ǖ淖饔谩�3. 以紫花苜蓿葉片為實驗材料,采用cDNA末端快速擴增技術(RACE)克隆得到紫花苜蓿4-羥基丙酮酸轉移酶cDNA, cDNA序列分析結果表明,其包含1305bp的開放閱讀框,編碼434個氨基酸,屬于Glo_EDI_BRP_like超家族,在序列的C和N末端各包含一個HPPD結構域,并且C端富含活性位點。多序列比對結果表明,紫花苜蓿HPPD與來自其他物種的HPPD相似性達到82.46%,三個決定該酶活性的鐵結合位點在不同的HPPD中高度保守,因此我們將該基因命名為MsHPPD。實時熒光定量PCR結果表明,MsHPPD在紫花苜蓿的各個組織中均有表達,其中在葉片中表達量最高。通過染色體步移技術獲得該基因的啟動子序列,并連入pBI121載體中,通過GUS染色分析結果表明,MsHPPD在擬南芥的子葉,主根,萼片,花瓣,柱頭,絲管,花粉以及種子果莢的末端都有強烈的GUS表達。真葉,根尖以及下胚軸中沒有GUS的表達。NaCl、脫落酸、PEG和黑暗都可以誘導MsHPPD的表達。將該基因轉入擬南芥,轉基因擬南芥種子中p-生育三烯酚以及維生素E總量含量顯著高于對照。且轉基因擬南芥種子在正常環(huán)境下發(fā)芽時間顯著早于對照,而在甘露醇和NaCl處理條件下發(fā)芽率顯著高于對照,并且對ABA處理不敏感。ABA含量測定結果表明,在干種子中ABA的含量在轉基因擬南芥和對照中差異不顯著,但在浸水36h的種子中,轉基因擬南芥ABA的含量顯著低于對照。同時,在干種子中,ABA合成基因NCED3,5,9以及ABA信號途徑的基因ABI3和AB15的表達量在轉基因擬南芥和對照中表達差異不顯著,而浸水后,表達量與對照相比均顯著降低。而MsHPPD的表達量在浸水顯著升高。將pBI121-MsHPPD-GUS雙元表達載體轉入紫花苜蓿后,轉基因紫花苜蓿葉片中維生素E的含量不變,但是粗蛋白含量與對照相比顯著提高。
[Abstract]:In order to improve the nutritional value of alfalfa and to optimize the content of vitamin E in transgenic Arabidopsis thaliana , the expression of 偽 - tocopherol and 偽 - tocotrienol in transgenic Arabidopsis was significantly increased . Real - time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the relative expression of MsHin various tissues . The results showed that the expression of MsHAs in roots , stems and leaves was the highest . 15 % PEG , NaCl , GA and ABA could induce the expression of the gene . The results showed that the content of the gene ABI3 and AB15 in the transgenic Arabidopsis was significantly higher than that of the control . The results showed that the content of the gene ABI3 and AB15 in the transgenic Arabidopsis was significantly higher than that of the control .
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

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本文編號：2043101