擬南芥卵形家族蛋白,即Arabidopsis thaliana Ovate Family Proteins(At OFPs),是一類新的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,它能夠調(diào)控植物多方面的生長和發(fā)育。At OFP1是At OFPs家族中的重要一員,也是這個家族中最先被發(fā)現(xiàn)的成員,現(xiàn)有研究證明它是一個轉(zhuǎn)錄抑制因子,能夠通過直接調(diào)控其下游的GA合成酶關(guān)鍵基因At GA20ox1的轉(zhuǎn)錄,抑制細胞的伸長,但其進一步的功能尚不明確,同時At OFP1本身并沒有可以預(yù)測的DNA結(jié)合域,所以其對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控需要通過與具有DNA結(jié)合域的其它蛋白因子相互作用而實現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄因子家族TALE同源結(jié)構(gòu)域蛋白,即Three-aa Loop Extension(TALE)homeodomain protein,就是一類已知的At OFP1潛在的互作蛋白,BLH類蛋白和KNOX蛋白同屬于TALE類轉(zhuǎn)錄因子。目前,通過對TALE類蛋白的分子遺傳學(xué)研究,已知其在植物發(fā)育過程中具有一些明確的形態(tài)調(diào)節(jié)功能,如決定葉片的形狀,控制植株花莖的生長和發(fā)育,以及調(diào)控營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變等,因此,AtOFP1可能通過與TALE類蛋白的互作在擬南芥的形態(tài)與發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究通過定向酵母雙雜交、免疫共沉淀和雙分子熒光互補等方法,從多個角度確定了OFP1能夠在體內(nèi)與BLH3、ATH1發(fā)生蛋白互作,同時進一步確定了BLH3、ATH1與OFP1發(fā)生蛋白互作的結(jié)構(gòu)域,然后通過原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染試驗明確了BLH3、ATH1的轉(zhuǎn)錄活性,并確定其轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域,其次明確了BLH3、ATH1基因在擬南芥中的表達特點,并基于相關(guān)基因突變體以及不同遺傳背景下的基因過表達體植株表型分析,闡述了OFP1-BLH3復(fù)合物和OFP1-ATH1復(fù)合物在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程中的相關(guān)功能,明確了OFP1與BLH3、ATH1的相互依賴關(guān)系,以及OFP1在OFP1-BLH3復(fù)合物和OFP1-ATH1復(fù)合物中的作用和角色,最后,Realtime-PCR試驗結(jié)果表明,OFP1和ATH1對赤霉素合成基因At GA20ox1與開花抑制基因FLC的表達可能均具有調(diào)控作用。研究將為進一步明確OFP以及TALE-OFPs復(fù)合物在植物發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)功能提供分子基礎(chǔ),對植物重要性狀的遺傳改良具有積極的指導(dǎo)意義。主要試驗結(jié)果如下:(1)OFP1與BLH3、ATH1在體內(nèi)互作分別形成一個蛋白復(fù)合物。通過酵母雙雜交證實OFP1能夠與BLH3、ATH1發(fā)生蛋白相互作用,通過免疫共沉淀和雙分子熒光互補進一步確定了這種相互作用。同時,OFP1與含有BLH3、ATH1不同結(jié)構(gòu)域的蛋白區(qū)段互作表明,BLH3和ATH1均是通過Homeodomain結(jié)構(gòu)域與OFP1發(fā)生蛋白互作的。(2)確定BLH3、ATH1的轉(zhuǎn)錄活性與轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域。原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染試驗結(jié)果表明,與對照相比BLH3激活GUS報告基因的表達量相對較高,是一個轉(zhuǎn)錄激活因子,ATH1與對照相比激活GUS報告基因的表達量相對較低,是一個轉(zhuǎn)錄抑制因子;含有不同BLH3、ATH1結(jié)構(gòu)域的蛋白區(qū)段轉(zhuǎn)染試驗結(jié)果表明,BLH3的轉(zhuǎn)錄激活域主要位于含有SKY-BELL結(jié)構(gòu)域的blh3的n端,ath1的轉(zhuǎn)錄抑制域同樣位于含有sky-bell結(jié)構(gòu)域的ath1的n端,此蛋白區(qū)段含有一個轉(zhuǎn)錄抑制的motif,即lxlxl。(3)ofp1能夠負調(diào)節(jié)blh3蛋白轉(zhuǎn)錄激活活性,ofp1能夠增強ath1蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制活性。瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)果表明,相比單獨轉(zhuǎn)染blh3,共同轉(zhuǎn)染ofp1和blh3時,gus報告基因表達量出現(xiàn)明顯降低,同時,由于過去的研究曾報道,blh3還可能與knox類蛋白互作,因此,ofp1能夠負調(diào)節(jié)blh3或者blh3-knox蛋白復(fù)合物,降低其轉(zhuǎn)錄活性;同時,相比單獨轉(zhuǎn)染ath1,共同轉(zhuǎn)染ofp1和ath1時,gus報告基因的表達量進一步降低,說明ofp1能夠增強ath1或者可能的ath1-knox蛋白復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄抑制活性。(4)ofp1與blh3、ath1具有相似的時空表達性,可能存在于同一細胞類型中。blh3prom:blh3的gus表達和rt-pcr表達結(jié)果顯示,blh3有和ofp1相類似的表達模式,包括葉、胚軸、近根部、根尖、花莖以及花。同時,ath1prom:ath1的gus表達和rt-pcr結(jié)果顯示,盡管ath1與ofp1在相同時空中的表達部位和表達量有著一定差異,但總體上具有相類似的表達模式,包括葉、胚軸、近根部、根尖、花莖以及花,試驗結(jié)果表明ofp1蛋白和blh3、ath1蛋白可能處于同一細胞類型中。因此,ofp1與blh3、ath1的蛋白互作是具有生物學(xué)意義的。(5)ofp1 blh3蛋白復(fù)合物的功能。35s:ofp1株系,35s:blh3株系,ofp1株系,blh3株系,35s:ofp1/blh3株系,35s:blh3/ofp1株系的形態(tài)學(xué)分析表明,ofp1-blh3蛋白復(fù)合物能夠調(diào)節(jié)植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變時間,blh3能夠促進這種轉(zhuǎn)變而不是抑制它,ofp1能夠降低blh3這種促進轉(zhuǎn)變的能力。同時,35s:ofp1/blh3株系與35s:ofp1株系相比,雖然其表型并未得到有效抑制,但是35s:ofp1/blh3株系的開花時間與葉片數(shù)量更接近于野生型,說明ofp1在調(diào)節(jié)植株從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變時間上,可能部分的依賴blh3去作用。(6)ofp1 ath1蛋白復(fù)合物的功能。35s:ofp1株系,35s:ath1株系,ofp1株系,ath1株系,35s:ofp1/ath1株系,35s:ath1/ofp1株系的形態(tài)學(xué)分析表明,ofp1 ath1復(fù)合物能夠調(diào)節(jié)植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變時間,但與blh3不同,ath1能夠抑制這種轉(zhuǎn)變而不是促進它,ofp1能夠進一步增強ath1這種抑制能力。同時,ofp1 ath1復(fù)合物能夠調(diào)節(jié)植物莖的伸長與花基底邊界的形成。試驗結(jié)果表明,相對野生型,ath1/ofp1株系與ofp1/ath1株系均出現(xiàn)不同程度的莖高降低的表型,同時,35s:ath1株系的莖高低于ath1/ofp1的莖高(p-values小于0.05),從形態(tài)學(xué)上證實了瞬時轉(zhuǎn)染的結(jié)果,即ofp1能夠增強ath1的轉(zhuǎn)錄抑制能力。ofp1株系與ath1株系均表現(xiàn)出花基底邊界出現(xiàn)不同程度融合的性狀,并且ofp1能夠與ath1在體內(nèi)發(fā)生互作,且都作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,暗示ofp1-ath1復(fù)合物可能處于共同的通路中調(diào)節(jié)植物花基底邊界的形成。此外,ofp1-ath1可能參與調(diào)控atga20ox1與flc。通過realitime分析相關(guān)基因的表達量,試驗結(jié)果表明,ofp1與ath1對赤霉素合成的一個關(guān)鍵酶基因atga20ox1的表達可能均具有調(diào)控作用;同時,ATH1和OFP1的表達量在短日照到長日照轉(zhuǎn)變過程中均出現(xiàn)下調(diào);此外,35S:ATH1株系和35S:OFP1株系的FLC(開花抑制基因)表達量均下調(diào)。



本文編號：2040713