發(fā)布時(shí)間：2016-12-02 20:48

  本文關(guān)鍵詞：新城疫病毒HN蛋白頭部保守氨基酸定位和功能研究及全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《山東大學(xué)》 2015年

新城疫病毒HN蛋白頭部保守氨基酸定位和功能研究及全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建

孫成璽  

【摘要】：研究背景副粘病毒(paramyxo virus)屬于單股負(fù)鏈RNA (-ssRNA)病毒。副粘病毒科(Paramyxoviridae)可分為兩個(gè)亞科：副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)和肺病毒亞科(Pneumovirinae)。副粘病毒亞科包括副粘病毒屬(Paramyxovirus)、麻疹病毒屬(Morbillivirus)和腮腺炎病毒屬(Rubulavirus),副粘病毒屬的主要成員有副流感病毒(parainfluenza virus, PIV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)和仙臺(tái)病毒(Sendai Virus, SeV),其中PIV和NDV是副粘病毒的典型代表；麻疹病毒屬只包括一種病毒即麻疹病毒(measles virus, MV),并且只能感染人類；腮腺炎病毒屬的代表性成員是流行性腮腺炎病毒(mumps virus, MuV);肺病毒亞科包括肺病毒屬,主要有呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)和禽肺病毒(avian pneumo virus, APV)。近年來又新發(fā)現(xiàn)了一些副粘病毒的成員,如亨德拉病毒(Hendra virus, HeV)、尼帕病毒(Nipah virus, NiV)、人類偏肺病毒(human metapneumovirus, hMPV)。副粘病毒可以感染人類、哺乳動(dòng)物和多種禽類,主要引起呼吸系統(tǒng)的感染性疾病,除此之外,還能引起生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)疾病。副粘病毒的形態(tài)類似于與流感病毒,但其病毒顆粒的體積稍大于流感病毒,病毒顆粒一般為球形,也可以呈現(xiàn)多形性,直徑約150～300nm。副粘病毒的基因組大小在13～16kb之間,為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒。典型的副粘病毒基因組包含6個(gè)基因,分別對(duì)應(yīng)6個(gè)開放讀碼框(open reading frame, ORF),從病毒的3'端開始分別編碼衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase, HN)和大分子蛋白(L)蛋白(3'-NP-P-M-HN-F-L-5'),每個(gè)ORF之間存在非編碼序列和調(diào)控序列。其中,NP、P和L蛋白構(gòu)成RNA依賴的RNA聚合酶復(fù)合體(RNA dependent RNA polymerase, RDRP),在病毒感染宿主細(xì)胞后合成病毒的mRNA; M蛋白能夠與NP、HN和F蛋白相結(jié)合,在病毒粒子的裝配及出芽過程中起到重要作用；HN和F蛋白是兩種位于病毒包膜表面的糖蛋白,其中吸附蛋白(HN)在副粘病毒的不同成員中具有不同的生物學(xué)功能,根據(jù)其功能不同,命名有所不同,如在NDV和hPIV中,吸附蛋白同時(shí)具有血吸附(HAD)和NA活性,被稱為HN蛋白；在MV中,吸附蛋白只有HAD而不表現(xiàn)出NA活性,因此將其命名為H蛋白；在NiV和HeV中,吸附蛋白既無(wú)HAD能力,又無(wú)NA活性,此時(shí)稱之為G蛋白。F蛋白能夠介導(dǎo)病毒包膜-細(xì)胞膜和細(xì)胞膜-細(xì)胞膜之間的融合,是病毒感染和致病的重要蛋白。在副粘病毒中,絕大多數(shù)成員的F蛋白(SV、NiV和HeV例外),需要同源的吸附蛋白的激活才能啟動(dòng)膜的融合過程。目前研究認(rèn)為,首先HN蛋白與細(xì)胞膜表面的唾液酸(sialic acid)受體結(jié)合,HN蛋白將某種信號(hào)傳遞至其頸部區(qū)域,隨后HN蛋白的頸部和F蛋白發(fā)生相互作用,將某種激活信號(hào)傳遞至F蛋白,F蛋白發(fā)生二硫鍵的重排使其構(gòu)象發(fā)生改變,原本包埋在F蛋白內(nèi)部的融合肽暴露并插入到細(xì)胞膜中,F蛋白發(fā)生內(nèi)部的β片層和α螺旋之間的轉(zhuǎn)換,重新折疊形成一種6聚體的束狀結(jié)構(gòu)(6HB),使病毒包膜和細(xì)胞膜足夠接近,形成融合小孔,最終完成融合的過程。在這個(gè)過程中HN蛋白與受體結(jié)合是激活整個(gè)事件的關(guān)鍵步驟,本研究擬在以前研究的基礎(chǔ)上,針對(duì)NDV HN蛋白頭部的保守氨基酸(aa),構(gòu)建突變體,并構(gòu)建頭部缺失的NDV HN突變體,通過檢測(cè)其功能的改變,弄清HN蛋白頭部保守aa對(duì)HN多種生活學(xué)功能的影響和HN蛋白在促細(xì)胞融合過程中所起到的作用和機(jī)制。研究目的通過觀察HN蛋白頭部區(qū)域高度保守的aa突變后蛋白功能的變化,定位HN頭部的關(guān)鍵aa；根據(jù)突變體受體結(jié)合能力、NA和促細(xì)胞融合活性改變程度的變化,分析這些關(guān)鍵的aa位點(diǎn)對(duì)其生物學(xué)功能的影響,闡述HN蛋白三種功能間的關(guān)系和HN蛋白頭部和頸部在激活F蛋白過程中的作用；通過研究NDV HN頭部缺失突變體的促細(xì)胞融合功能來研究NDV HN頸部在促細(xì)胞融合過程中的作用。研究方法1. NDV HN頭部保守aa突變體構(gòu)建：比對(duì)NDV、hPIV 3、MV、SeV、HeV和NiV吸附蛋白序列,確定NDV HN蛋白頭部3組高度保守的aa,分別為：E401、G402、R403、G468、V469、Y470、Y526、T527和T528,通過定點(diǎn)突變的方法將上述aa突變?yōu)楸彼?A)；2.突變體的表達(dá)：利用陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Reagent將含突變HN基因的質(zhì)粒和野毒株(wt)F質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,利用痘苗病毒-T7瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)各個(gè)突變體；3.突變體表達(dá)效率的檢測(cè)：NDV HN頭部突變體的定性表達(dá)情況由簡(jiǎn)介免疫熒光實(shí)驗(yàn)(ⅡFA)檢測(cè)；利用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)技術(shù)分析NDV HN頭部突變體在細(xì)胞膜表面的表達(dá)效率；4.蛋白功能的檢測(cè)：在細(xì)胞表面表達(dá)NDV HN突變體后HAD試驗(yàn)定性和定量測(cè)定各突變體的受體結(jié)合能力；利用R18熒光探針標(biāo)記的鴿紅細(xì)胞與共表達(dá)突變體HN和野毒株(wt)F蛋白的細(xì)胞進(jìn)行半融合試驗(yàn),檢測(cè)NDV HN突變體在促細(xì)胞融合的啟動(dòng)過程當(dāng)中的速率改變和合胞體形成情況；Giemsa染色對(duì)各個(gè)NDV HN頭部突變體引起的細(xì)胞融合現(xiàn)象進(jìn)行定性觀察,并且利用指示基因法(report gene method)定量測(cè)定各個(gè)突變體的促細(xì)胞融合功能；NDV HN突變體與β-半乳糖苷酶底物反應(yīng)后,利用比色法定量測(cè)定突變體的NA活性；5.構(gòu)建HN蛋白頭部缺失的NDV HN突變體,分別在37℃和39.5℃的條件下共轉(zhuǎn)染野毒株F蛋白,Giemsa染色觀察NDV HN頭部缺失突變體介導(dǎo)的合胞體形成情況。研究結(jié)果1.突變體E401A、G402A、R403A、G468A、V469A、Y470A、Y526A、T527A和T528A突變體均構(gòu)建成功。FACS分析表明突變體E401A、G402A、G468A、V469A、Y526A和T527A表達(dá)成功,其細(xì)胞表面的表達(dá)效率分別為wt的69.3%、101.4%、94.6%、92.0%、84.1%和102.9%；而突變體R403A、Y470A和T528A通過ⅡFA和FACS分析均未檢測(cè)到在細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)部的表達(dá)；2. NDV HN蛋白的功能檢測(cè)結(jié)果顯示,E401A和Y526A突變體的HAD活性基本消失,降低到wt的7.3%和7.9%,其NA降低到了wt的10.1%和0.4%,促細(xì)胞融合活性降低到了wt的2.4%和3.2%；G402A和T527A性突變體的HAD活為wt的71.5%和49.2%,與其神經(jīng)氨酸酶和促細(xì)胞融合活性的下降程度相當(dāng),分別為72.8%,35.5%和53.4%和54.2%；G468A的HAD基本沒有下降,為wt的93.9%,而其NA下降到了wt的35.3%,促細(xì)胞融合活性下降至wt的70.0%,其NA的下降程度遠(yuǎn)大于HAD活性和促細(xì)胞融合活性下降的幅度；與之不同的是V469A突變體的HAD活性為wt的46.5%,NA為wt的68.1%,而促細(xì)胞融合活性降低到了wt的12.4%,其促細(xì)胞融合活性的下降程度遠(yuǎn)大于HAD活性和NA下降的幅度；3.HN和F蛋白相互作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：第一,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,融合的程度與HN和F蛋白的相互作用程度成反比,E401A和Y526A突變體仍與F蛋白有較強(qiáng)的相互作用,而HAD活性幾乎沒有下降的G468A突變體與F蛋白的相互作用則較弱；第二,用R18標(biāo)記豚鼠紅細(xì)胞后,與共表達(dá)NDV HN和F蛋白的細(xì)胞在37℃條件下的融合速率未發(fā)生明顯變化,但是形成合胞體的數(shù)目和直徑均小于wtHN和F蛋白共表達(dá)實(shí)驗(yàn)組；4.頭部缺失的NDV HNs與同源的F蛋白共表達(dá)時(shí),在37℃和39℃時(shí)均出現(xiàn)了合胞體,但是合胞體的數(shù)目和直徑均小于wt的HN和F蛋白共表達(dá)實(shí)驗(yàn)組。結(jié)論1.E401和Y526位點(diǎn)是NDV HN頭部區(qū)域有關(guān)受體結(jié)合的關(guān)鍵aa,其突變導(dǎo)致受體結(jié)合活性的喪失；E401A和Y526A突變體所引起的神經(jīng)氨酸酶和促細(xì)胞融合活性的消失是因?yàn)槭荏w無(wú)法結(jié)合所導(dǎo)致的；2.G402和T527位點(diǎn)其突變導(dǎo)致HN受體結(jié)合能力、NA和促細(xì)胞融合活性的相應(yīng)降低,但是仍能夠引起細(xì)胞的融合,說明次位點(diǎn)參與了HN的受體結(jié)合過程,但并不是HN蛋白促細(xì)胞融合過程中的關(guān)鍵aa；3.G468和V469位點(diǎn)突變所引起的HN受體結(jié)合能力、NA和促細(xì)胞融合活性的降低程度不同,證明G468和V469在平衡和轉(zhuǎn)換NDV HN蛋白NA和HAD生物學(xué)作用的過程中起到了重要的作用；4. NDV HN激活F蛋白的區(qū)域在其頸部,融合前未結(jié)合受體的HN蛋白頭部抑制了F蛋白的融合激活過程。研究背景新城疫病毒(Newcastle disease vims,NDV)屬于副粘病毒科,副粘病毒亞科,是副粘病毒的典型代表成員。ND是一種烈性的禽類傳染病,其暴發(fā)對(duì)禽類養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生致命性打擊。目前由于減毒活疫苗的使用,ND的流行基本可控制,但是RNA病毒高突變率的特性決定了NDV的潛在威脅無(wú)法徹底消除。NDV為不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒,原先被歸類于腮腺炎病毒屬,后來基于免疫學(xué)、血清學(xué)研究和基因特征分析結(jié)果,Peeters等學(xué)者認(rèn)為其應(yīng)列為副祐病毒科中一個(gè)單獨(dú)的屬,即現(xiàn)在所說的禽腮腺炎病毒屬按照毒力分?jǐn)?shù)NDV可分為強(qiáng)度型(velogenic)、中等毒型(mesogenic)和弱毒型(lentogenic)或無(wú)毒型(asymptomatic)�；贔蛋白高可變區(qū)(47?420nt)的系統(tǒng)發(fā)生分析將NDV分為9型(I?IX),這9個(gè)基因型按照出現(xiàn)的時(shí)間分為兩大分支,第一支是1960s前的I、II、111、IV和IX型,第二支是1960s之后的VI、VII和VIII型,其中IX型出現(xiàn)的時(shí)間為1960s之后,但是系統(tǒng)發(fā)生分析認(rèn)為它是來源于III型的一個(gè)古老的分支。自然界中,NDV的宿主非常廣泛,幾乎所有的禽類都是其宿主,而雞類尤其易感。通常情況下認(rèn)為,水禽對(duì)NDV有較強(qiáng)的抵抗力,感染后并不引起嚴(yán)重的癥狀或者不發(fā)病,因此巧生的水禽類是NDV的儲(chǔ)存池。近年來,世界不同地區(qū)不斷有NDV在水禽中暴發(fā)流行的報(bào)道,國(guó)內(nèi)也在家養(yǎng)的鷄和鴨中出現(xiàn)了ND的暴發(fā)流行。是否是NDV在進(jìn)化的過程中發(fā)生了適應(yīng)性變異,導(dǎo)致對(duì)水禽的致I病性增強(qiáng)的原因仍需要進(jìn)一步的研究。系統(tǒng)發(fā)生分析作為研究病毒進(jìn)化和演變的強(qiáng)有力工具,在NDV的進(jìn)化分析和分型中起到了重要的作用。本研究中對(duì)NDVBJ株的基因序列特征進(jìn)行了分析,試圖從系統(tǒng)發(fā)生的角度探討NDV的演變過程和起源,W及新的病毒亞型不斷出現(xiàn)的可能原因和機(jī)制。反向遺傳學(xué)(reverse genetics)又稱為病毒逐救(rescue of virus),是通過人工的方法構(gòu)建具有感染性的全長(zhǎng)cNDA克隆,從而逆向分析病毒致病機(jī)制的一種新興的分子生物學(xué)技術(shù)。隨著RNA病毒反向遺傳技術(shù)的成熟,已經(jīng)有多株NDV被挺救成功的報(bào)道。這為研究分析NDV的進(jìn)化及致病機(jī)制創(chuàng)造了更好的條件。但是目前成功魅救的NDV病毒主要為弱毒株,而強(qiáng)毒株的搔救少有報(bào)道。本硏究構(gòu)建了強(qiáng)度株NDV BJ株的全長(zhǎng)cDNA和輔助質(zhì)粒系統(tǒng),旨在捶救NDV BJ株,W進(jìn)一步的進(jìn)行副巧病毒致病機(jī)制研究和表達(dá)外源基因、作為新型疫苗載體等相關(guān)的應(yīng)用性研究。研究目的獲得純化的NDV BJ巧,并測(cè)定其毒力;PCR擴(kuò)增得到NDV BJ株的全序列,測(cè)序后利用系統(tǒng)發(fā)生的方法分析其進(jìn)化演變過程和可能的起源;構(gòu)建全長(zhǎng)的cDNA和輔助質(zhì)粒系統(tǒng),為下一步的病毒強(qiáng)救王作提供基礎(chǔ)。研究方法1.利用有限稀釋法通過睡斑試驗(yàn)純化NDVBJ株,通過9日齡雞化尿囊腔接種測(cè)定雞胚平均死亡恃間(mean death time,MDT),—日齡錐雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(intracerebral pathogenicity index,ICPI)測(cè)定病毒的毒力。2.設(shè)計(jì)口對(duì)PCR引物,對(duì)通過RT-PC民和PCR的方法,分別擴(kuò)增NDV BJ株基因片段,連接入T載體后,測(cè)定NDVBJ株全基因組序列;對(duì)其F基因和L基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析,分析NDV BJ株的進(jìn)化特征和可能起源。3.根據(jù)NDVBJ株的基因序列,尋找基因組中合適的酶切位點(diǎn),采用基因克隆的方法,構(gòu)建NDVBJ株的全長(zhǎng)cDNA,將其連接入pVAX表達(dá)載體。4.分別設(shè)計(jì)PC民產(chǎn)物和合適的酶切位點(diǎn),擴(kuò)増NP(約1.5kb)、P(約1.3化)和L(約6.7化)基因的開放讀碼框(ORF)后,連接入T載體,測(cè)序驗(yàn)證后,根據(jù)兩端設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn),連接入pVAX載體,構(gòu)建NDVBJ株的輔助質(zhì)粒pVAX-P,pVAX-NP和pVAX-L。5.巧用PCR擴(kuò)增病毒的3刑5味端的非編碼調(diào)控序列,擴(kuò)增NDV BJ株的leader區(qū)和trailer去引物,PCR擴(kuò)増得到目的片段;設(shè)計(jì)引物,WpEGFP-N3為模板,擴(kuò)增EGFP基因;通過重組PC民的方法在Leader區(qū)和Trailer區(qū)的中間反向插入綠色巧光蛋白(EGFP)基因,構(gòu)建微基因組pVAX-TGL,驗(yàn)證輔助質(zhì)粒系統(tǒng)的功能。研究結(jié)果1.通過有限稀釋法從嗦斑中得到了純化的NDV BJ株病毒,并通過PCR擴(kuò)增,得到NDVBJ株全序列為15192nt,序列己上傳GenBank(ID:HQ3n394)。2.NDV BJ株的毒力檢測(cè)結(jié)果顯示,MDT為。.他,解剖死亡的雞胚發(fā)現(xiàn)有廣泛的組織粘連、出血,甚至組織溶解;ICPI為1.92,一日齡維雞在腦內(nèi)接種NDVBJ株W后,迅速出現(xiàn)快速劇良、搖頭、站立不穩(wěn)、翅下垂、雍轟等癥狀,30h內(nèi)死亡;綜上述,NDVBJ株符合強(qiáng)毒株的特征,為強(qiáng)毒株。3.通過對(duì)F蛋白高可變區(qū)(47?435nt)的系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果顯示NDV BJ株屬于IX型;從親緣關(guān)系上看IX型與m和IV型的關(guān)系最近,而與I型和II型的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),但是總體來看,I型和II型并未與曲、IV和IX型位于同一分支;基于F基因全長(zhǎng)的系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明,I、II、III、IV和IX型位于同一分支,V、VI、VII和vm型位于同一分支從進(jìn)化關(guān)系上分化NDVBJ株屬于III型的姐妹分支,是一個(gè)古典的NDV毒株的變異株,并且具有近年來NDV流行株的特點(diǎn)。對(duì)L基因的系統(tǒng)分析結(jié)果顯示了同樣的結(jié)果。4.成功構(gòu)建了輔助質(zhì)粒系統(tǒng);輔助質(zhì)粒和微基因組能夠共轉(zhuǎn)染能夠表達(dá)EGFP,說明了NP、P和L基因能夠正常表達(dá),并形成具有生物學(xué)功能的RNA聚合酶復(fù)合體。結(jié)論1.NDVBJ株是屬于新城疫病毒IX型的、毒力極強(qiáng)的分離株,其感染能夠引起雞胚和維雞的迅速死亡。2.基于系統(tǒng)發(fā)生分化NDV BJ株可能是III/IV型和VI-VIII型的重組株,是NDV進(jìn)化過程中的一個(gè)過渡株。3.NDB BJ株的輔助質(zhì)粒系統(tǒng)能夠形成具有生物學(xué)活性的RNA聚合酶復(fù)合物,能夠使微基因組表達(dá)綠色巧光蛋白,證明輔助質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建成功。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

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  本文關(guān)鍵詞：新城疫病毒HN蛋白頭部保守氨基酸定位和功能研究及全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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