發(fā)布時間：2018-06-16 01:11

  本文選題：Magnetospirillum + gryphiswaldense��； 參考：《中國農(nóng)業(yè)大學》2017年博士論文

【摘要】：趨磁細菌是能在胞內(nèi)合成特殊細胞器—磁小體,并沿磁力線排列和運動細菌的總稱。磁小體由四氧化三鐵或四硫化三鐵納米磁顆粒及其外包被的生物膜組成,粒徑分布在30～120 nm之間。由于趨磁細菌細胞結(jié)構(gòu)和基因組構(gòu)成簡單,是研究生物礦化的模式生物。目前趨磁細菌的研究主要集中于磁小體合成機制,尤其是磁小體島基因的研究,島外基因功能及調(diào)控機制的研究較少。前期的實驗證據(jù)表明磁小體的合成與氧化還原密切相關(guān)。本工作以格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1)為材料,研究兩個oxyR同源基因的功能及調(diào)控機制。實驗室在前期工作中已經(jīng)構(gòu)建了基因oxyR-Like的缺失突變和互補菌株,通過對其一系列表型的測定,發(fā)現(xiàn)其磁小體合成嚴重受阻,并利用表達譜測定了突變株中基因的總體表達情況,但OxyR-Like的調(diào)控機制并沒有被闡明。本文利用凝膠阻滯(EMSA)和DNaseI足跡實驗深入的研究了 OxyR-Like的調(diào)控機制。結(jié)果表明,OxyR-Like可以結(jié)合MGMSRv-2_0006基因,pdhA基因簇以及mcpA基因的啟動子區(qū)。利用DNaseI足跡實驗找到了 OxyR-Like結(jié)合的DNA保守序列5'-ATN{3}AN{5}TTATCA-3'。利用qRT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)突變株中所有與三羧酸循環(huán)相關(guān)的基因表達量均下調(diào),暗示在突變株中能量代謝受到抑制。oxyR-4250基因是MSR-1中另外一個oxyR同源基因。本文構(gòu)建了 oxyR-4250的缺失突變株和互補菌株,并對其表型進行了測定。結(jié)果表明,oxyR-4250缺失突變株生長緩慢,完全失去磁感應能力,且鐵吸收能力相比野生型菌株下降五倍。通過透射電鏡對突變株進行觀察,發(fā)現(xiàn)在突變株中磁小體數(shù)量變少,粒徑變小,并且不再成鏈排列。EMSA實驗結(jié)果表明,OxyR-4250可以調(diào)控ahpC和sodB基因的表達,證明OxyR-4250在MSR-1中可以調(diào)控抗氧化基因的表達。但在MSR-1中OxyR-4250并不調(diào)控katE,katG等在大腸桿菌中受OxyR調(diào)控的基因,說明在MSR-1中其他抗氧化調(diào)控機制的存在。通過在EMSA結(jié)合體系中加入還原劑,證明了 OxyR-4250可以響應環(huán)境中的氧化還原信號,從而改變其DNA結(jié)合能力。但EMSA實驗并未發(fā)現(xiàn)OxyR-4250可以結(jié)合磁小體島基因簇的啟動子區(qū),說明OxyR-4250不能直接調(diào)控磁小體的合成。DNase I足跡實驗證明OxyR-4250結(jié)合DNA的保守序列為5'-TCGATTTNTNTNANNANNANAACTCNT-3'。定點突變后的 EMSA 實驗結(jié)果證明 OxyR-4250蛋白中212Cys在其結(jié)合DNA過程中起關(guān)鍵作用。綜上所述,本論文首次闡明了磁螺菌MSR-1中兩個oxyR同源基因的功能,明確了 OxyR-Like 調(diào)控能量代謝相關(guān)的基因并與磁小體合成相關(guān);明確了 OxyR-4250 在 MSR-1 中不同于大腸桿菌中的抗氧化調(diào)控機制,為胞內(nèi)氧化還原的調(diào)控與磁小體形成直接相關(guān)提供了證據(jù)。
[Abstract]:Magnetotactic bacteria are the general names of bacteria which can synthesize special organelles-magnetic bodies and arrange and move along the magnetic line of force. The magnetic bodies are composed of Fe _ 2O _ 3 or Fe _ 2O _ 4 nanoparticles and their biofilms. The particle size is between 30 ~ 120 nm. Because of the simple cell structure and genome composition of magnetotactic bacteria, it is a model organism to study biomineralization. At present, the research of magnetotactic bacteria is mainly focused on the mechanism of magnetosome synthesis, especially on the gene of magnetic body island. Previous experimental evidence shows that the synthesis of magnetic bodies is closely related to redox. In this work, the function and regulatory mechanism of two oxyR homologous genes were studied using Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 as a material. The deletion and complementary strains of oxyR-Like gene have been constructed in our laboratory. Through a series of phenotypic tests, we found that the magnetic body synthesis was seriously blocked, and the expression profile was used to determine the overall expression of genes in the mutant strain. However, the regulatory mechanism of OxyR-Like has not been clarified. In this paper, the regulatory mechanism of OxyR-Like was studied by gel blocking EMSA) and DNase I footprint experiments. The results showed that OxyR-Like could bind MGMSRv-20006 gene to PDHA gene cluster and promoter region of mcpA gene. The OxyR-Like binding DNA conserved sequence 5- ATN {3} an {5} TTATCA-3 was found by using DNase I footprint test. By using qRT-PCR, we found that all the genes related to tricarboxylic acid cycle were down-regulated, suggesting that the energy metabolism of the mutant was inhibited. OxyR-4250 gene was another oxyR homologous gene in MSR-1. The deletion mutant and complementary strain of oxyR-4250 were constructed and their phenotypes were determined. The results showed that the mutant strain was slow to grow and completely lost its magnetic induction ability, and its iron absorption capacity was five times lower than that of the wild-type strain. The results of transmission electron microscopy (TEM) showed that the number of magnetic corpuscles became smaller and the particle size became smaller, and the results of EMSA experiment showed that OxyR-4250 could regulate the expression of ahpC and sodB genes in the mutant, and the results of EMSA experiment showed that OxyR-4250 could regulate the expression of ahpC and sodB genes. It is suggested that OxyR-4250 can regulate the expression of antioxidant genes in MSR-1. However, OxyR-4250 did not regulate the OxyR regulated genes in Escherichia coli such as katEkatG in MSR-1, indicating the existence of other antioxidant regulatory mechanisms in MSR-1. It is proved that OxyR-4250 can respond to the redox signal in the environment and change its DNA binding ability by adding reducing agent in EMSA binding system. However, the EMSA experiment did not find that OxyR-4250 could bind to the promoter region of the magnetic body island gene cluster, which indicated that OxyR-4250 could not directly regulate the synthesis of magnetic bodies. DNase I footprint experiments showed that the conserved sequence of OxyR-4250 binding DNA was 5- TCGATTTNTNANNANAACTCNT-3. The EMSA results of site-directed mutation showed that 212Cys in OxyR-4250 protein played a key role in its binding to DNA. To sum up, the function of two oxyR homologous genes in magnetic spirilli MSR-1 was first elucidated, and the genes related to the regulation of energy metabolism by OxyR-Like were identified and related to the synthesis of magnetic bodies. The antioxidant regulation mechanism of OxyR-4250 in MSR-1 was clarified, which provided evidence for direct correlation between intracellular redox regulation and magnetic body formation.
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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本文編號：2024517