發(fā)布時間：2018-06-10 14:12

  本文選題：棉鈴蟲 + 中腸　； 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景及存在的科學(xué)問題程序性細(xì)胞死亡(PCD)主要包括有自噬和凋亡。自噬是指當(dāng)細(xì)胞受到壓力或營養(yǎng)缺乏時,細(xì)胞將自身的一些損傷蛋白或細(xì)胞器降解掉從而產(chǎn)生能量讓自己存活下來的過程。凋亡是指機(jī)體通過自身基因及其產(chǎn)物主動而有序的調(diào)控機(jī)體死亡的過程,稱為Ⅰ型PCD。對于自噬的功能目前主要存在兩種觀點(diǎn):一種是自噬導(dǎo)致細(xì)胞存活,在眾多的哺乳動物細(xì)胞中,如在人類的成纖維和T細(xì)胞中,自噬是一種存活過程。另一種是自噬是一種死亡過程,既Ⅱ型PCD,如在果蠅中腸的降解。因此,自噬究竟是存活還是死亡、自噬與凋亡之間究竟存在著一種什么關(guān)系以及自噬轉(zhuǎn)向凋亡的分子機(jī)制是當(dāng)今亟待解決的科學(xué)問題。昆蟲在經(jīng)歷幼蟲到蛹的轉(zhuǎn)變過程中,舊的中腸會發(fā)生PCD降解,包括自噬與凋亡,因此昆蟲中腸PCD為研究自噬和凋亡以及二者的關(guān)系提供了理想模型。雙翅目昆蟲果蠅中腸PCD是一種自噬性死亡,沒有凋亡性死亡,而鱗翅目昆蟲家蠶中腸PCD中卻是先發(fā)生自噬,然后發(fā)生凋亡,但家蠶中腸PCD自噬轉(zhuǎn)化成凋亡的機(jī)制尚不清楚。因此,不同昆蟲中腸的PCD的機(jī)制有所不同。昆蟲PCD的發(fā)生依賴于蛻皮激素(20-Hydroxyecdysone,20E),在家蠶脂肪體中,20E可以通過上調(diào)自噬相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)脂肪體PCD。在家蠶絲腺中,20E可以引起胞內(nèi)Ca2+水平的升高最終活化下游的Caspase-3導(dǎo)致PCD。鈣離子的變化和平衡對細(xì)胞行使多種功能有著重要的作用,胞質(zhì)中的鈣離子水平相對較低,而胞外可以維持較高的鈣離子水平。在一些細(xì)胞中,胞內(nèi)鈣離子的增加可以促進(jìn)自噬。另外還有一些細(xì)胞中,胞內(nèi)鈣離子的增加可以活化鈣依賴蛋白酶Calpain,Calpain一旦活化后,就會引起自噬相關(guān)蛋白5(ATG5)切割成氨基端ATG5(NtATG5),這樣自噬的過程就會受阻,凋亡就會增強(qiáng)。因此,我們推測20E增加的細(xì)胞內(nèi)Ca2+在自噬與凋亡的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。為了驗(yàn)證我們的假設(shè)以及解決自噬研究領(lǐng)域存在的科學(xué)問題,我們以鱗翅目昆蟲棉鈴蟲的中腸PCD作為模型,并以棉鈴蟲的表皮細(xì)胞系(HaEpi)作為平臺開展研究,以回答自噬的功能究竟是一種存活還是死亡,自噬與凋亡究竟是一種什么關(guān)系以及自噬轉(zhuǎn)向凋亡的分子機(jī)制等科學(xué)問題。研究結(jié)果在鱗翅目昆蟲棉鈴蟲中,自噬相關(guān)基因(ATGs)和凋亡相關(guān)基因(Caspases)都在變態(tài)期高表達(dá),而且都響應(yīng)20E的誘導(dǎo)。大部分自噬相關(guān)基因的表達(dá)要先于凋亡相關(guān)基因。20E可以誘導(dǎo)微管輕鏈3蛋白-磷脂酰乙醇胺(LC3-Ⅱ,又名ATG8)的形成,表明自噬受20E的誘導(dǎo),但是轉(zhuǎn)染pIEx-RFP-GFP-LC3-His熒光雙標(biāo)簽質(zhì)粒進(jìn)一步檢測自噬發(fā)現(xiàn),20E誘導(dǎo)的自噬不能持續(xù)下去,這表明自噬在20E誘導(dǎo)的晚期呈現(xiàn)出下降趨勢,而凋亡卻顯著增加,說明20E誘導(dǎo)的自噬最終轉(zhuǎn)向了凋亡。在鱗翅目昆蟲棉鈴蟲中腸程序性細(xì)胞死亡過程中(PCD),既存在自噬也存在凋亡而且自噬發(fā)生在前凋亡的發(fā)生在后。LC3-Ⅱ形成的增加預(yù)示自噬的水平的增加;活化的Caspase-3和流式細(xì)胞儀用于檢測凋亡的水平。凋亡發(fā)生時Caspase-3被活化同時自噬相關(guān)蛋白ATG5被切割產(chǎn)生氨基端ATG5(NtATG5)。在棉鈴蟲的表皮細(xì)胞系(HaEpi)中,相對較低濃度20E情況下,LC3-Ⅱ的形成增多預(yù)示著自噬會逐漸增強(qiáng),在相對較高濃度的20E情況下,ATG5被切割成為NtATG5,Caspase-3的活性逐漸增強(qiáng),預(yù)示著自噬轉(zhuǎn)向了凋亡。當(dāng)干擾ATG5或施加自噬的抑制劑3-甲基嘌呤(3-MA)時,20E誘導(dǎo)的自噬和凋亡會受到抑制。但是,當(dāng)施加凋亡的抑制劑Ac-DEVD-CHO時,可以抑制20E誘導(dǎo)的凋亡,但沒有阻止20E誘導(dǎo)的自噬。這暗示了自噬控制并決定凋亡。另外,高濃度20E可以誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+水平升高促進(jìn)ATG5的切割成NtATG5,Caspase-3的活化,進(jìn)而將自噬轉(zhuǎn)向凋亡。阻止20E誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+的升高將會導(dǎo)致NtATG5以及活化的Caspase-3下降,細(xì)胞會維持自噬存活。在人類乳腺癌細(xì)胞中,20E可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,但是當(dāng)施加高濃度的Ca2+時,自噬會轉(zhuǎn)化成凋亡。這些結(jié)果表明胞內(nèi)高濃度的Ca2+將細(xì)胞自噬性存活轉(zhuǎn)為凋亡性死亡,而且20E誘導(dǎo)了胞內(nèi)高濃度的Ca2+促進(jìn)了自噬向凋亡的轉(zhuǎn)化。結(jié)論1.自噬是一種存活過程,凋亡是一種細(xì)胞死亡過程。當(dāng)?shù)蛲鍪艿揭种茣r,細(xì)胞將處于自噬的存活狀態(tài)。這與果蠅中腸的自噬死亡不一樣,可能是物種間調(diào)控機(jī)制的差異。2.20E誘導(dǎo)中腸自噬和凋亡先后發(fā)生并促使自噬向凋亡轉(zhuǎn)化。自噬是凋亡的前提,凋亡終結(jié)自噬。闡明了中腸中自噬與凋亡的關(guān)系不是簡單的拮抗關(guān)系。3.20E通過增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度促進(jìn)自噬向凋亡轉(zhuǎn)化。高濃度的20E誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+增加,高水平的Ca2+使ATG5被切割成NtATG5進(jìn)而活化Caspase-3引起凋亡。抑制Ca2+通道可以阻止自噬向凋亡的轉(zhuǎn)化。在沒有鈣離子時自噬不能被轉(zhuǎn)化成凋亡。該結(jié)果在人乳腺癌細(xì)胞中可以得到驗(yàn)證。確定了自噬轉(zhuǎn)向凋亡的關(guān)鍵因子是鈣離子�？茖W(xué)意義闡明了 20E調(diào)控鈣離子增加,介導(dǎo)自噬轉(zhuǎn)化為凋亡是中腸PCD的分子機(jī)制;自噬是一種存活過程而凋亡是一種細(xì)胞死亡過程;Ca2+離子的濃度決定了自噬向凋亡的轉(zhuǎn)化。豐富了昆蟲中腸PCD的理論,為防治病蟲害提供了新的靶標(biāo)。為自噬的功能及在細(xì)胞存活與死亡中的機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。
[Abstract]:The research background and existing scientific problems of programmed cell death (PCD) mainly include autophagy and apoptosis. Autophagy refers to the process that cells degrade some of their damaged proteins or organelles when they are subjected to pressure or nutritional deficiency to generate energy for their own survival. Apoptosis refers to the body through its own genes and their products. The active and orderly process of regulating the death of the body, known as type I PCD., has two main views on autophagy: one is autophagy that leads to cell survival. In many mammalian cells, autophagy is a survival process, such as in human fibroblasts and T cells. The other is that autophagy is a death process, both type II PC. D, such as the degradation of the midgut in the Drosophila. Therefore, whether autophagy is alive or dead, what is the relationship between autophagy and apoptosis and the molecular mechanism of autophagy to apoptosis is a scientific problem to be solved today. In the course of the transition from larva to pupae, the insect is degraded in the old midgut, including autophagy and apoptosis, including autophagy and apoptosis. Therefore, the midgut PCD in insects provides an ideal model for the study of autophagy and apoptosis and the relationship between the two. The midgut PCD of the Diptera Insect is a autophagy death and no apoptotic death. However, autophagy occurs in the midgut PCD of the Lepidoptera silkworm, and then apoptosis occurs, but the mechanism of PCD autophagy in the midgut of the Bombyx mori is not yet a mechanism of apoptosis. It is clear that the mechanism of PCD in the midgut of different insects is different. The occurrence of insect PCD is dependent on the ecdysone (20-Hydroxyecdysone, 20E). In the fat body of the silkworm, 20E can promote the fat body PCD. in the silk gland by up regulation of autophagy related genes and apoptosis related genes, and 20E can cause the increase of intracellular Ca2+ level most. The final activation of the downstream Caspase-3 leads to the change and balance of PCD. calcium ions to play an important role in the exercise of various functions. The level of calcium ions in the cytoplasm is relatively low, while the extracellular calcium levels can maintain high levels of calcium ions. In some cells, the increase of intracellular calcium can promote autophagy. In addition, some cells, intracellular calcium, are also available. The increase of ions activates calcium dependent protease Calpain, when Calpain is activated, it causes autophagy related protein 5 (ATG5) to cut into the amino terminal ATG5 (NtATG5), so the process of autophagy will be blocked and apoptosis will increase. Therefore, we speculate that the intracellular Ca2+ in 20E has an important role in the transformation of autophagy and apoptosis. On the basis of our hypothesis and the scientific problems that exist in the field of autophagy, we use the midgut PCD of the Lepidoptera cotton bollworm as a model, and take the epidermal cell line (HaEpi) of the cotton bollworm as a platform to study whether the function of autophagy is a survival or death, and what is the relationship between autophagy and apoptosis. The molecular mechanism of autophagy turned to apoptosis. In the Lepidoptera cotton bollworm, the autophagy related genes (ATGs) and apoptosis related genes (Caspases) are highly expressed in the metamorphosis stage, and all respond to the induction of 20E. Most autophagy related genes are expressed first by apoptosis related gene.20E to induce microtubule light chain 3 protein - The formation of phosphatidylethanolamine (LC3- II, also known as ATG8) showed that autophagy was induced by 20E, but the transfection of pIEx-RFP-GFP-LC3-His fluorescence double label plasmid further detected autophagy found that the autophagy induced by 20E could not continue, indicating that autophagy showed a downward trend in the late stage of 20E induction, while apoptosis was significantly increased, indicating 20E induced autophagy. Apoptosis. In the middle intestinal programmed cell death (PCD) of Lepidoptera (Lepidoptera, Helicoverpa armigera), there is both autophagy and apoptosis and the occurrence of autophagy occurring before the apoptosis of.LC3- II indicates an increase in the level of autophagy; activated Caspase-3 and flow cytometry are used to detect the level of apoptosis. When Caspase-3 was activated and autophagy associated protein ATG5 was cut to produce amino terminal ATG5 (NtATG5). In the epidermis cell line (HaEpi) of Helicoverpa armigera (HaEpi), relatively low concentration 20E, the increase of LC3- II indicates that autophagy increases gradually. In relatively high concentration of 20E, ATG5 is cut into NtATG5, Caspase-3 activity gradually Enhancement indicates autophagy to apoptosis. When 3- methyl purine (3-MA) is used to interfere with ATG5 or autophagy, the autophagy and apoptosis induced by 20E can be inhibited. However, when the apoptosis inhibitor Ac-DEVD-CHO is applied, the apoptosis induced by 20E can be inhibited, but the autophagy induced by 20E is not prevented. This implies autophagy control and determines apoptosis. In addition, high concentration of 20E can induce the increase of intracellular Ca2+ level and promote the cleavage of ATG5 into NtATG5, the activation of Caspase-3, and then the autophagy to apoptosis. To prevent 20E induced intracellular Ca2+ rise will lead to the decrease of NtATG5 and activated Caspase-3, and the cell will maintain autophagy. In human breast cancer cells, 20E can induce autophagy. However, when high concentration of Ca2+ was applied, autophagy could be transformed into apoptosis. These results suggest that high intracellular concentration of Ca2+ turns autophagic survival to apoptotic death, and 20E induces high intracellular concentration of Ca2+ to promote the transformation of autophagy to apoptosis. Conclusion 1. autophagy is a survival process and apoptosis is a cell death process. At the time of inhibition, the cell will be in the state of autophagy. This is different from the autophagy death in the midgut of the Drosophila. It may be the difference between the regulation mechanism of the species..2.20E induces autophagy and apoptosis in the midgut and promotes autophagy to apoptosis. Autophagy is the precondition of apoptosis. Apoptosis terminates autophagy. The relationship between autophagy and apoptosis is clarified. Not a simple antagonistic relationship.3.20E promotes autophagy by increasing intracellular calcium concentration to promote autophagy to apoptosis. High concentration of 20E induces intracellular Ca2+ increase, high level Ca2+ causes ATG5 to be cut into NtATG5 and activates Caspase-3 to induce apoptosis. Inhibition of Ca2+ channels can prevent autophagy from transforming into apoptosis. Autophagy can not be used in the absence of calcium ions. Transformation into apoptosis. This result can be verified in human breast cancer cells. The key factor for autophagy to apoptosis is calcium ion. Scientific significance clarifies that 20E regulates the increase of calcium ions and mediates the transformation of autophagy into apoptosis as a molecular mechanism of midgut PCD; autophagy is a survival process and a cell death process; Ca2+ ions The concentration determines the transformation of autophagy to apoptosis. It enriches the theory of PCD in the midgut of insects and provides a new target for the prevention and treatment of diseases and insect pests. It provides a new theoretical basis for the function of autophagy and the mechanism of cell survival and death.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q25

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙勇;師長宏;伍靜;張海;;自噬的形態(tài)特征及分子調(diào)控機(jī)制[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2010年10期

2 伍靜;趙勇;師長宏;張海;;自噬的形態(tài)特征及分子調(diào)控[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年20期

3 杜萬清;俞立;;自噬過程的晚期階段[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報;2011年01期

4 王光輝;;自噬與疾病[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2012年03期

5 方夢蝶;劉波;劉偉;;自噬的分子細(xì)胞機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報;2012年04期

6 高雅;邢皓;于愛鳴;;自噬與腫瘤[J];中國科技信息;2012年14期

7 謝洪;李艷君;陳英玉;;線粒體自噬[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2011年12期

8 丁渭;張玉林;陳德喜;;自噬——凋亡之后的新理念[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2012年05期

9 孫鵬;宋錦寧;;高遷移率族蛋白1介導(dǎo)自噬發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報;2013年07期

10 李寶華;熊思東;;自噬對胞內(nèi)感染病原體的雙重作用[J];微生物與感染;2006年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 韋雪;漆永梅;張迎梅;;鎘、活性氧自由基與自噬發(fā)生的分子機(jī)制[A];中國活性氧生物學(xué)效應(yīng)學(xué)術(shù)會議論文集（第一冊）[C];2011年

2 秦正紅;粱中琴;陶陸陽;黃強(qiáng);劉春風(fēng);蔣星紅;倪宏;邢春根;;自噬在細(xì)胞生存與死亡中的作用[A];中國藥理學(xué)會第九次全國會員代表大會暨全國藥理學(xué)術(shù)會議論文集[C];2007年

3 秦正紅;;自噬與腫瘤和神經(jīng)細(xì)胞生存——藥物作用的新靶位[A];全國生化與分子藥理學(xué)藥物靶點(diǎn)研討會論文摘要集[C];2008年

4 李芹;丁壯;;自噬功能研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2013年

5 胡晨;張璇;滕衍斌;胡海汐;周叢照;;家蠶中自噬相關(guān)蛋白Atg8的結(jié)構(gòu)研究[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會2009年學(xué)術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2009年

6 陳希;李民;Xiao-Ming Yin;李林潔;;通過不同途徑誘導(dǎo)自噬的化合物對Atg9的依賴性不同[A];細(xì)胞—生命的基礎(chǔ)——中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會2013年全國學(xué)術(shù)大會·武漢論文摘要集[C];2013年

7 陳涓涓;敬靜;蔡元博;張俊龍;;針對活體細(xì)胞自噬行為的發(fā)光金屬配合物的設(shè)計[A];中國化學(xué)會第28屆學(xué)術(shù)年會第8分會場摘要集[C];2012年

8 寧曉潔;鐘自彪;王彥峰;付貞;葉啟發(fā);;缺血再灌注誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞自噬[A];2013中國器官移植大會論文匯編[C];2013年

9 吳曉琦;李丹丹;鄧蓉;江山;楊芬;馮公侃;朱孝峰;;CaMKKβ磷酸化Beclin 1調(diào)控自噬及其在腫瘤治療中的作用[A];2011醫(yī)學(xué)科學(xué)前沿論壇第十二屆全國腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

10 周鴻雁;裴中;陳杰;申存周;錢浩;劉妍梅;冼文彪;鄭一帆;陳玲;;線粒體動力改變參與了LRRK2突變導(dǎo)致的自噬[A];中華醫(yī)學(xué)會第十三次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

相關(guān)重要報紙文章 前3條

1 生命學(xué)院;俞立課題組在《科學(xué)》發(fā)文揭示自噬調(diào)控的重要機(jī)制[N];新清華;2012年

2 周飛 張粹蘭;花櫚木“自噬”可抗癌[N];廣東科技報;2011年

3 張明永;水稻自噬基因研究取得新進(jìn)展[N];廣東科技報;2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 賈盛楠;轉(zhuǎn)錄因子p8調(diào)控自噬的功能研究[D];浙江大學(xué);2015年

2 皮會豐;DNM1L蛋白介導(dǎo)的線粒體自噬在鎘致肝臟毒性中的作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 李倩;miRNAs介導(dǎo)的自噬抑制在類鼻疽桿菌感染免疫逃逸中的作用機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

4 黎炳護(hù);激活TRPV1誘導(dǎo)自噬在血管平滑肌細(xì)胞泡沫化中作用及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 陳江偉;自噬在椎間盤退變中的作用及機(jī)制研究[D];上海交通大學(xué);2014年

6 李榮榮;自噬在布比卡因肌毒性中的作用及機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

7 王維;NF-κB信號通路參與介導(dǎo)的自噬在高血壓大鼠心血管重構(gòu)的作用研究[D];山東大學(xué);2015年

8 劉春朋;日糧硒缺乏對雞肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)及自噬變化的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 梁蓓蓓;P53凋亡刺激蛋白ASPP2調(diào)控細(xì)胞自噬的研究[D];上海交通大學(xué);2012年

10 袁揚(yáng);線粒體自噬的抗缺血性腦損傷作用及其調(diào)控機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 匡紅;Jnk2通過smARF的降解來調(diào)控壓力誘導(dǎo)的線粒體自噬及組織損傷[D];浙江理工大學(xué);2015年

2 洪永桃;自噬在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞中的作用及甲氨蝶呤對自噬的影響[D];川北醫(yī)學(xué)院;2015年

3 李寧;自噬在嗎啡心肌保護(hù)中的作用及機(jī)制研究[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

4 劉冰;腦缺血預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注后自噬及凋亡的影響[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

5 王存凱;microRNA-30a-5p通過抑制自噬阻止肝星狀細(xì)胞激活[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 張宇程;泛素連接酶HOIL-1L在線粒體自噬中的功能與機(jī)制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

7 唐芙蓉;自噬對奶山羊雄性生殖干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

8 陳軍童;腎損傷分子1對高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞自噬作用的影響[D];鄭州大學(xué);2015年

9 包勇;Kap1在LBH589誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7自噬形成中的作用[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

10 魏園玉;P53缺失型HL-60白血病細(xì)胞內(nèi)Nucleostemin下調(diào)對mTOR通路介導(dǎo)的自噬活性的影響[D];鄭州大學(xué);2015年

，

本文編號：2003496