本文選題：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒 + 轉(zhuǎn)錄組學(xué)　； 參考：《揚(yáng)州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(Reticuloendotheliosis)是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus)引起的一系列家禽疾病的總稱。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒為反轉(zhuǎn)錄病毒科禽類C型反轉(zhuǎn)錄病毒,感染后主要引起感染家禽免疫功能抑制和慢性腫瘤,該病的控制對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展和生物制品質(zhì)量的提高具有重大影響。家禽感染REV后所產(chǎn)生的免疫抑制現(xiàn)象是該病對(duì)禽類養(yǎng)殖造成損失的重要原因,造成這一結(jié)果的主要機(jī)制有對(duì)宿主免疫器官造成實(shí)質(zhì)性的損傷,干擾免疫細(xì)胞的活化和增殖,以及抑制固有免疫細(xì)胞的活性。但是,關(guān)于病毒與宿主細(xì)胞之間的分子互作機(jī)制和致病機(jī)理,目前仍不十分清楚。本研究以REV HA1101毒株為研究對(duì)象,并應(yīng)用基因芯片分析了感染雞胚成纖維細(xì)胞的差異表達(dá)基因,并以此為基礎(chǔ)觀察了病毒感染不同宿主細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)改變、生物化學(xué)改變、相關(guān)免疫基因的變化及可能的調(diào)控機(jī)制,為解答REV感染宿主的免疫抑制和致病機(jī)理提供了重要數(shù)據(jù)和線索。1.多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)REV方法的建立本研究根據(jù)發(fā)表的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)基因序列,分別針對(duì)gag、env以及LTR基因的保守序列設(shè)計(jì)了三對(duì)引物,利用重組質(zhì)粒作為模板,建立了三種不同基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立的多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)REV方法在標(biāo)準(zhǔn)品模板為108拷貝/μ1～101拷貝／μl范圍內(nèi)與CT值之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,且最低檢出量為101拷貝／μl。研究結(jié)果顯示,REV感染CEF后gag、env以及LTR基因的拷貝數(shù)均呈現(xiàn)先減少后增多的變化過程。該研究不僅為REV的診斷技術(shù)提供了一種新的方法,同時(shí)也為深入研究REV的感染機(jī)制和致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。2.REV感染宿主細(xì)胞CEF的轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究本研究旨在了解該病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系,利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)以及熒光PCR方法,在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)病毒感染宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)。結(jié)果表明,病毒感染1d、3d、5d以及7d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)共鑒定出1785個(gè)差異表達(dá)基因,其中參與免疫反應(yīng)的相關(guān)基因在病毒感染后期呈現(xiàn)顯著的差異性變化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),差異基因主要參與信號(hào)傳導(dǎo)、免疫反應(yīng)、自噬作用以及細(xì)胞粘附作用等,其中相關(guān)信號(hào)通路有MAPK信號(hào)通路、JAK/STAT信號(hào)通路以及Toll樣受體信號(hào)通路等。在眾多差異基因中,IL-6、STAT-1、Myd-88、 TLRs、NF-κB、IRFs以及ISGs等在病毒感染過程中可能發(fā)揮著更為重要的作用,但其相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本研究首次對(duì)REV感染宿主的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行研究,從而為該病毒的致病機(jī)理以及先天免疫途徑等奠定了基礎(chǔ)。3.不同細(xì)胞中REV增殖效力研究REV的流行病學(xué)以及分子生物學(xué)研究已取得了一定的進(jìn)展,但是目前用于REV的細(xì)胞培養(yǎng)體系只限于雞成纖維細(xì)胞,而REV的靶向?yàn)槊庖邔?shí)質(zhì)器官,這就限制了對(duì)REV的深刻認(rèn)識(shí)。本研究選取雞成纖維細(xì)胞系DF1、雞巨噬細(xì)胞系HD11、雞T淋巴細(xì)胞系MSB1 以及雞B淋巴細(xì)胞系進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)。通過建立的方法對(duì)病毒感染水平檢Real-timePCR測(cè)。研究發(fā)現(xiàn),感染后REV拷貝數(shù)在不同的細(xì)胞系中均呈現(xiàn)漸進(jìn)增加趨勢(shì);病毒在成纖維細(xì)胞系中的復(fù)制效率區(qū)別于免疫細(xì)胞系中的復(fù)制效率。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)可觀察到病毒感染DF1細(xì)胞后在96h可見明顯陽性反應(yīng),而這三種免疫細(xì)胞系在HD11、MSB1、DT4048h前均可見陽性反應(yīng)。此外,顯微鏡下觀察免疫細(xì)胞系與成纖維細(xì)胞系在形態(tài)學(xué)上存在一定區(qū)別,主要反應(yīng)在免疫細(xì)胞在感染后期出現(xiàn)細(xì)胞碎片增多,細(xì)胞密度降低、體積縮小、折光性減弱等現(xiàn)象。本研究首次進(jìn)行REV體外感染免疫細(xì)胞,提供了相應(yīng)的感染條件和規(guī)律,為進(jìn)一步研究和完善相關(guān)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。4.REV感染引起免疫細(xì)胞凋亡的機(jī)理研究REV感染引起宿主細(xì)胞凋亡并造成免疫器官的實(shí)質(zhì)性損傷,該損傷與免疫細(xì)胞的凋亡有關(guān)。本研究利用REV分別感染DF1細(xì)胞、HD11細(xì)胞、細(xì)胞、以及DT40細(xì)胞等MSB1不同細(xì)胞系后,利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長活力,然后通過熒光染色法和TUNELV/PI流式細(xì)胞術(shù)觀察REV對(duì)免疫細(xì)胞的凋亡影響,并利用Annexin檢測(cè)凋亡相關(guān)信Real-time PCR號(hào)分子9的表達(dá),結(jié)果顯示,REV感染后的免疫細(xì)胞生長活力顯著低于正Caspase-3、8、常培養(yǎng)細(xì)胞,且隨著病毒感染量及培養(yǎng)時(shí)間的增加,對(duì)免疫細(xì)胞生長抑制作用也顯著增加；TUNEL檢測(cè)方法標(biāo)記感染后的免疫細(xì)胞,激光共聚焦對(duì)其掃描觀察發(fā)現(xiàn),感染后凋亡細(xì)胞出現(xiàn)紅色的陽性深染現(xiàn)象,而正常細(xì)胞未被染色；此外出現(xiàn)核染不規(guī)則、核濃縮等明顯的凋亡特征；利用Real-time PCR方法對(duì)Caspase-3、8、9等信號(hào)分子表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),REV感染免疫細(xì)胞后凋亡相關(guān)分子的nRNA表達(dá)水平顯著升高,其中Caspase-3活性顯著提高。本研究首次體外發(fā)現(xiàn)REV能夠誘導(dǎo)多種類型免疫細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象,為進(jìn)一步研究REV感染后細(xì)胞凋亡通路提供參考依據(jù),同時(shí)詮釋了REV所引起的免疫抑制現(xiàn)象。5.REV感染抑制天然免疫機(jī)理研究免疫識(shí)別與調(diào)節(jié)的分子機(jī)制是當(dāng)今免疫學(xué)研究的重要領(lǐng)域。天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體抗病毒入侵的“第一道防線”,其中模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors, PRRs)通過識(shí)別表達(dá)在病毒、細(xì)菌和真菌組成物上廣譜的病原體相關(guān)分子模式,啟動(dòng)宿主抗感染的天然免疫反應(yīng)。為了進(jìn)一步了解REV感染不同宿主細(xì)胞對(duì)先天免疫的影響,本研究選擇不同時(shí)間點(diǎn),利用REV分別感染DF1細(xì)胞、HD11細(xì)胞、MSB1細(xì)胞、以及DT40細(xì)胞,并對(duì)PRRs以及下游通路的相關(guān)細(xì)胞因子的基因表達(dá)變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。研究發(fā)現(xiàn),感染DF1細(xì)胞后,基因表達(dá)變化與前期實(shí)驗(yàn)中REV感染CEF情況一致；而HD11、MSB1、DT40三種免疫細(xì)胞系的PRRs基因表達(dá)變化呈現(xiàn)整體的下調(diào)現(xiàn)象,其中以TLR-3以及MDA5的變化最為顯著,同時(shí)下游相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平也出現(xiàn)下調(diào)。以配體LPS和ploy(I:C)激活相應(yīng)通路信號(hào)后,再進(jìn)行REV感染實(shí)驗(yàn),這三種免疫細(xì)胞的PRRs以及下游通路的相關(guān)細(xì)胞因子激活可抑制病毒感染,提示REV對(duì)免疫細(xì)胞的先天免疫有著抑制調(diào)控作用,宿主機(jī)體的先天免疫作用被損害及缺失是一個(gè)重要威脅關(guān)鍵點(diǎn)。該研究結(jié)果對(duì)明確REV免疫抑制機(jī)理具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。
[Abstract]:Avian reticuloendotheliosis virus ( REV ) was used as template to detect the immune function and the pathogenesis of REV infection . In this study , we used the method of CCK - 8 to detect the apoptosis of immune cells . The results showed that the growth of immune cells after REV infection was significantly lower than that of positive Caspase - 3 , 8 , and the growth of immune cells was significantly increased with the increase of the amount of virus infection and the time of culture .
TUNEL assay was used to mark immune cells after infection , and laser confocal microscopy revealed that apoptotic cells appeared red positive staining after infection , while normal cells were not stained .
In addition , there were obvious apoptotic characteristics , such as irregular nuclear staining , nuclear concentration and so on .
In order to further understand the effect of REV infection on the apoptosis of different host cells , the mechanism of immune recognition and regulation is the first defense line . In order to further study the effect of REV infection on the apoptosis of cells in different host cells , this study selects different time points , and uses REV to infect DF1 cells , HD11 cells , MSB1 cells , and DT40 cells .
The changes of PRRs gene expression of three kinds of immune cell lines of HD11 , MSB1 and DT40 showed that the changes of TLR - 3 and MDA5 were the most significant , and the expression level of downstream related cytokines was downregulated .
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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3 金文杰,崔治中,劉岳龍,秦愛建;傳染性法氏囊病病料中MDV、CAV、REV的共感染檢測(cè)[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2001年01期

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本文編號(hào)：1913489