本文選題：呼吸化學感受性反射 + 瘦素��； 參考：《河北醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：呼吸化學感受器反射是一種重要的呼吸穩(wěn)態(tài)調節(jié)機制,是機體與外界環(huán)境進行氣體交換的主要方式,是維持正常新陳代謝和酸堿平衡的重要保證。呼吸化學感受性反射的反射弧由感受器、傳入神經(jīng)、呼吸中樞、傳出神經(jīng)和效應器組成。呼吸化學感受器又分為外周化學感受器和中樞化學感受器。外周化學感受器主要位于頸動脈體和主動脈體,又以頸動脈體為主,監(jiān)測動脈血中PaCO2、PaO2和[H+]的增加;其傳入神經(jīng)為竇神經(jīng)。中樞化學感受器主要位于低位腦干,包括孤束核(NTS),斜方體后核(RTN),迷走神經(jīng)背核,延髓腹外側頭端區(qū),中縫核和藍斑核等,與呼吸中樞之間通過突觸聯(lián)系在一起。呼吸的節(jié)律中樞主要位于延髓腹側,最終通過傳出神經(jīng)支配到效應器——呼吸肌上。當機體吸入過多CO2時主要興奮中樞化學感受器反射,反射性的使呼吸加深加快,排除過多的CO2,維持機體酸堿平衡。當機體缺氧時,主要興奮外周化學感受器反射,反射性的使呼吸加深加快,以達到吸入更多O2,維持機體正常供氧的作用。一旦呼吸化學感受性反射的感受器和/或呼吸中樞等部位發(fā)生結構或功能性改變,呼吸化學感受器反射不能正常進行,產(chǎn)生呼吸障礙疾病,如低通氣綜合征等。影響呼吸化學感受器反射的因素有很多,肥胖就是其中重要原因之一。肥胖造成的呼吸負荷過重和中樞驅動力的下降都是產(chǎn)生肥胖低通氣的主要因素。近年研究發(fā)現(xiàn)由脂肪因子分泌的、在調節(jié)脂代謝平衡的關鍵因子——瘦素(Leptin),可能也參與了呼吸的調控作用,但其機制和作用靶點尚不明確。已有文獻證實頸動脈體球細胞上主要分布有多種Leptin受體,其中起主要作用的是Leptin受體b亞型,即ob-Rb。同樣在中樞化學感受器多部位上也發(fā)現(xiàn)有Leptin受體的廣泛分布。已有研究發(fā)現(xiàn)Leptin缺乏的ob/ob小鼠高碳酸性通氣反應(Hypercapnic Ventilatory Response,HCVR)減弱,而外源性補充Leptin可逆轉此現(xiàn)象。但迄今為止,Leptin參與呼吸調控是否是通過其受體激活下游分子通路來實現(xiàn)的還未見報道,且其作用部位和作用機制仍需進一步研究。綜上所述,本研究旨在進一步觀察leptin系統(tǒng)是否參與呼吸化學感受器反射的調節(jié),并驗證此作用是否通過其受體及其下游通路來實現(xiàn)的,試圖明確其作用環(huán)節(jié)、位點和機制。本研究以臨床肥胖低通氣綜合癥(obesityhypoventinationsyndrome,ohs)作為呼吸障礙模型,利用ob-rb受體缺陷zucker肥胖大鼠作為leptin信號通路缺陷組,借助無創(chuàng)體積描記系統(tǒng)(小動物肺功能測定)、分子生物學、免疫組織化學等技術,深入探討以下幾點內容:(1)明確leptin是否能易化中樞和外周呼吸化學感受性反射;(2)上述作用是否為受體依賴的,是否通過其下游信號通路來實現(xiàn);(3)探討leptin易化中樞呼吸化學感受性反射的作用靶點及其可能的機制;(4)明確leptin易化外周呼吸化學感受性反射的作用環(huán)節(jié)靶點和其可能的機制。第一部分:leptin易化中樞呼吸化學感受性反射的作用目的:通過激活和抑制leptin信號通路兩種手段,證實leptin對中樞呼吸化學感受器反射的易化作用。方法:第一部分實驗利用ob-rb缺陷大鼠,觀察抑制leptin信號通路對中樞呼吸化學感受器反射的影響。實驗動物分為四組:對照瘦zucker大鼠組(lean)和三組不同的肥胖低通氣模型組,即單純性肥胖低通氣模型組(lean-hfd);ob-rb缺陷大鼠組(obese)和ob-rb缺陷大鼠合并過度肥胖組(obese-hfd)。測定大鼠血漿leptin水平和孤束核ob-rb下游通路中pstat3/stat3蛋白表達,驗證各組動物leptin信號通路的功能狀態(tài);利用wbp清醒呼吸記錄系統(tǒng),描記清醒大鼠呼吸功能,階梯性的給各組動物吸入含有2%,5%和8%co2的混合氣體,記錄每分通氣量(mv)、潮氣量(tv)和呼吸頻率(bf)等呼吸參數(shù)的變化,以確定抑制leptin信號通路對hcvr敏感性的影響。第二部分實驗通過皮下注射leptin,觀察激活leptin信號通路對hcvr敏感性的影響。實驗動物分為四組:對照注射鹽水組(lean+saline)、對照注射leptin組(lean+leptin)、ob-rb缺陷注射鹽水組(obese+saline)和ob-rb缺陷注射leptin組(obese+leptin)。lean+leptin和obese+leptin組大鼠連續(xù)皮下注射leptin(60μg/kg)7天,停藥恢復21天,共計觀察28天。lean+saline和obese+saline組注射相同劑量的生理鹽水,作為空白對照。測定血漿leptin水平和孤束核leptin受體下游通路pstat3/stat3蛋白表達,以確定激活leptin信號通路的效果。利用wbp描記清醒呼吸功能,確定激活leptin信號通路對hcvr反應敏感性的影響。本部分使用的動物均預先去除雙側竇神經(jīng),已排除外周化學感受器的干擾。結果:1lean-hfd、obese和obese-hfd組大鼠體重均高于lean組(p0.01),且伴有清醒時高碳酸血癥(p0.01)。obese和obese-hfd組大鼠血漿leptin水平均高于lean組,pstat3的蛋白表達均低于lean組(p0.01)。而lean-hfd組大鼠的血漿leptin水平和pstat3的蛋白表達與lean組無差異。2基礎狀態(tài)下(100%o2),lean-hfd、obese和obese-hfd組大鼠的mv、tv均低于lean組,bf明顯高于lean組(p0.01)。結果表明,上述3組肥胖動物都存在低通氣現(xiàn)象。3階梯性吸入高濃度co2后,4組大鼠的mv均隨co2濃度的增加而增加。其中l(wèi)ean-hfd組mv隨co2濃度的增加,反應性逐漸趨向于lean組,在給予5%和8%co2時,和lean組已無差異。但obese組和obese-hfd組對co2的反應明顯低于lean組(p0.01),而obese組和obese-hfd組間無差異。4lean+leptin和obese+leptin組大鼠在注射leptin和消退過程中體重均逐漸增長,與注射saline組大鼠無明顯差異。在注射leptin期間,lean+leptin和obese+leptin組大鼠血漿leptin水平均升高4-8μg/l(p0.05~0.01),停藥后逐漸消退。5在注射leptin的第7天,lean+leptin組大鼠孤束核pstat3/stat3表達明顯升高(p0.01),而obese+leptin組大鼠相對于obese+saline組無明顯差異。6在注射leptin的第7天,lean+leptin和obese+leptin組大鼠動脈血paco2和ph值與lean+saline和obese+saline組大鼠無顯著性差異。7在注射leptin的第7天,清醒常氧平靜呼吸時,lean+leptin和obese+leptin組大鼠的mv、tv和bf值和lean+saline和obese+saline組相比無顯著性差異。同樣,各組大鼠注射前、注射第7天、消退各時間點的基礎mv均無顯著性差異,結合上述注射leptin后結果,說明注射leptin可以有效地激活leptin信號通路,但并不影響動物基礎體重、血氣和呼吸。8在注射leptin的第7天、消退的第1周、第2周,階梯性升高co2各組大鼠吸入氣體中的co2,lean+leptin組大鼠的mv變化幅度明顯高于lean+saline組(p0.01)。而obese+leptin組大鼠與obese+saline組的mv值無差異,說明注射leptin可以易化hcvr。小結:ob-rb缺陷可以降低動物對co2和/或高碳酸反應的敏感性;激活leptin信號通路可以增加對co2和/或高碳酸反應的敏感性,且能維持兩周。此作用可能通過leptin受體信號通路及下游蛋白水平改變所實現(xiàn)。第二部分:孤束核參與leptin易化高碳酸性通氣反應目的:通過激活和抑制leptin信號通路兩種手段,探討nts在leptin易化呼吸中的作用和可能機制。方法:第一部分觀察ob-rb缺陷對nts酸敏感通道和受體的蛋白表達和co2敏感性神經(jīng)元的數(shù)目的影響。實驗動物分為3組:對照瘦zucker大鼠組(lean)、單純性肥胖低通氣模型組(lean-hfd)和ob-rb缺陷大鼠組(obese)。利用westernblot方法檢測各組動物基礎狀態(tài)下nts組織中task通道、asic通道gpr4和kir2.3蛋白水平。用免疫熒光的方法統(tǒng)計各組動物經(jīng)8%co2處理后,nts上co2敏感性神經(jīng)元的數(shù)目。第二部分觀察激活leptin信號通路對nts酸敏感通道和受體的蛋白表達和co2敏感性神經(jīng)元的數(shù)目的影響。實驗動物分為4組:lean+saline組、lean+leptin組、obese+saline組和obese+leptin組。利用westernblot方法檢測各組動物nts上task通道、asic通道gpr4和kir2.3蛋白水平。用免疫熒光的方法統(tǒng)計各組動物經(jīng)8%co2處理1小時后,nts的co2敏感性神經(jīng)元的數(shù)目。結果:1基礎狀態(tài)下,ob-rb缺陷的obese組大鼠nts組織中的task-1,-2和-3通道蛋白,asic-1和-2通道,gpr4受體蛋白和kir2.3通道蛋白表達明顯低于lean組和lean-hfd組(p0.01),而lean和lean-hfd兩組間無差異。2激活leptin信號通路后,lean+leptin組大鼠nts組織中task-1,-2和-3通道蛋白,asic-1和-2通道,gpr4受體蛋白和kir2.3通道蛋白表達明顯高于lean+saline組(p0.01),而obese+saline組與obese+leptin組大鼠nts組織中上述通道和受體蛋白水平無顯著性差異。3經(jīng)8%co2處理1h復氧1h后,obese組大鼠共表達ob-rb和c-fos的神經(jīng)元總數(shù)目明顯低于lean組和lean-hfd組(p0.01),而lean組和lean-hfd兩組間無差異。說明obese組大鼠co2敏感性神經(jīng)元數(shù)目與lean組和lean-hfd組相比較少。4經(jīng)8%co2處理1h復氧1h后,lean+leptin組大鼠共表達ob-rb和c-fos的神經(jīng)元總數(shù)目明顯高于lean+saline組(p0.01),而obese+saline組與obese+leptin組大鼠組間無差異。說明激活leptin信號通路可以增加co2敏感性神經(jīng)元數(shù)目。小結:leptin信號通路易化中樞化學感受器反射的作用可能通過leptin及其信號通路增加nts神經(jīng)元敏感性和上調nts組織中task通道、asic通道、gpr4受體和kir2.3通道等酸敏感性通道表達所實現(xiàn)。第三部分:leptin易化外周呼吸化學感受性反射的作用和機制目的:通過激活和抑制leptin信號通路兩種手段,探討頸動脈體的leptin信號通路對外周呼吸化學感受器反射的易化作用及其可能的機制。方法:激活和抑制leptin信號通路的動物分組同第二部分。本部分比較各組動物雙側竇神經(jīng)完整和切除雙側竇神經(jīng)后,各組動物對低氧(10%o2)反應的差異,利用wbp記錄清醒低氧性通氣反應(hvr)的呼吸功能;westernblot法檢測各組動物基礎狀態(tài)下頸動脈體氧敏感性通道task-1,-2,-3和kv1.5通道的蛋白表達,比較各組動物基礎狀態(tài)和低氧狀態(tài)下頸動脈體c-fos蛋白的表達的變化。結果:1常氧狀態(tài)下,ob-rb缺陷的obese組大鼠頸動脈體ob-rb受體蛋白和pstat3蛋白水平明顯低于lean組和lean-hfd組(p0.01)。2暴露于10%o2時,3組大鼠的mv都相對常氧時增加。而ob-rb缺陷大鼠在低氧時mv的變化值(△mv)明顯低于對照組和飲食誘導的單純肥胖大鼠(p0.01)。切斷雙側竇神經(jīng)后,上述3組大鼠低氧時△mv均明顯減少,且組間無顯著性差異。3皮下注射leptin60μg/kg7天后,lean+leptin組大鼠頸動脈體的ob-rb受體蛋白和pstat3蛋白水平明顯高于lean組(p0.01),而obese+saline組與obese+leptin組大鼠頸動脈體的ob-rb受體蛋白和pstat3蛋白組間無顯著性差異。4皮下注射leptin第7天,lean+leptin組大鼠在低氧(10%)時的mv、tv和bf與lean組相比明顯增加(p0.05~0.01)。而obese+leptin與obese+saline組大鼠的mv、tv和bf值無顯著差異。5皮下注射leptin第7天,切除雙側竇神經(jīng)的各組動物,對低氧(10%o2)的反應明顯減弱,mv的變化都明顯減少,且3組無顯著差異。6皮下注射leptin第14天,lean+leptin組大鼠在低氧時的mv與仍明顯高于lean組(p0.01)。而obese+leptin組大鼠的mv值與obese+saline組相比無顯著差異。7基礎狀態(tài)下,obese組大鼠頸動脈體的task-1、task-2、task-3和kv1.5的蛋白表達均低于lean和lean-hfd組(p0.05~0.01),而lean和lean-hfd組間無顯著性差異。8皮下注射leptin第7天,lean+leptin組大鼠頸動脈體的task-1、task-2、task-3和kv1.5的蛋白表達均高于lean(p0.01)。而obese+saline與obese+leptin組間無明顯差異。9在急性低氧處理前,lean、lean-hfd和obese組大鼠c-fos蛋白表達無差異,而在急性低氧處理后,雖3組動物頸動脈體的c-fos蛋白表達均有所升高,但obese組大鼠明顯低于lean和lean-hfd組(p0.01)。10皮下注射leptin第7天,在急性低氧處理前,4組大鼠c-fos蛋白表達無差異,而在急性低氧處理后,4組動物頸動脈體的c-fos蛋白表達均有所升高,其中l(wèi)ean+leptin組大鼠明顯高于其他3組(p0.01);而obese+saline與obese+leptin組間無明顯差異。小結:ob-rb缺陷降低hvr的敏感性,而激活leptin信號通路可以增加hvr的敏感性,且能維持一周。leptin易化hvr的作用可能與其信號通路參與調節(jié)task-1,-2,-3andkv1.5等氧敏感性通道有關。第四部分:慢性間歇性低壓低氧易化中樞呼吸化學感受性反射目的:觀察慢性間歇性低壓低氧對大鼠基礎呼吸和高碳酸性通氣反應敏感性的影響,并探討其可能機制。方法:動物分為四組,對照組(control)、cihh處理組(cihh)、果糖誘導的肥胖組(hfd)和果糖誘導的肥胖大鼠經(jīng)cihh處理組(CIHH-HFD)。利用WBP記錄清醒低氧性通氣反應(HCVR)的呼吸功能;用生物化學或分子生物學的方法檢測血生化等指標。結果:1 HFD組大鼠在清醒常氧狀態(tài)下,其每分通氣量(MV),潮氣量(TV),均明顯低于對照組,而經(jīng)低氧處理后,CIHH-HFD組大鼠的MV和TV與對照組無顯著性差異。各組動物的呼吸頻率(F)均無統(tǒng)計學差異。2當高氧高碳酸時,4組大鼠的MV隨CO2濃度的增加而增加,但HFD組大鼠對CO2的反應明顯低于對照組,而經(jīng)CIHH處理后這一現(xiàn)象被改善。3四組大鼠的TV隨CO2濃度的增加而增加,但HFD組大鼠的TV隨CO2增加的幅度低于對照組(P0.05~0.01,Fig.3B),而經(jīng)CIHH處理后這一現(xiàn)象被改善。4四組大鼠的F隨CO2濃度的增加而增加,而HFD組大鼠的呼吸頻率在5%和8%CO2時明顯高于對照組,而經(jīng)CIHH處理后這一現(xiàn)象被改善。小結:CIHH可以改善果糖誘導的肥胖大鼠常氧狀態(tài)下的低通氣和對高碳酸性通氣反應的敏感性,而這一作用可能是通過上調Leptin來實現(xiàn)的。結論:Leptin信號通路可易化中樞和外周呼吸化學感受器反射。其易化中樞化學性反射通過增加NTS神經(jīng)元敏感性和上調NTS組織中Tasks通道,ASICs通道,GPR4和Kir2.3通道等酸敏感性通道表達所實現(xiàn)。其易化外周化學性反射通過上調頸動脈體的TASK-1,-2,-3 and Kv1.5等氧敏感性所實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q434

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本文編號：1851513