本文選題：新一代測(cè)序 + 高性能計(jì)算平臺(tái)��； 參考：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：當(dāng)前,由未確證的和新出現(xiàn)的病原體引發(fā)的疾病負(fù)擔(dān)在日益加重,這對(duì)人類的生命健康安全造成了越來越嚴(yán)重的威脅。近年來,我國(guó)多地發(fā)生了多起由新突發(fā)病原微生物引起的疫情,如2003年的SARS(severe acute respiratory syndrome)冠狀病毒,2006年的禽流感,2009年開始的甲型H1N1流感和2013年H7N9流感。在世界范圍內(nèi),還有2011年5月出現(xiàn)的德國(guó)大腸桿菌O104:H4疫情,2011年7月出現(xiàn)的荷蘭超級(jí)耐藥肺炎克雷伯菌Oxa4疫情,以及2014年震驚世界的西非埃博拉病毒疫情。實(shí)現(xiàn)對(duì)未知病原微生物的快速準(zhǔn)確檢測(cè)是重大疫情疾控和日常生物安全監(jiān)督的基本要求,同樣地,在臨床上實(shí)現(xiàn)病原微生物的準(zhǔn)確鑒定對(duì)于臨床正確診斷與有效防治也是至關(guān)重要。傳統(tǒng)的病原微生物鑒定技術(shù)主要分為兩類:基于細(xì)胞培養(yǎng)的方法例如形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞生理生化特征、細(xì)菌培養(yǎng)分型、基因芯片、自動(dòng)化微生物分析系統(tǒng)等,和基于特異引物/探針/抗體的方法例如抗原抗體反應(yīng)、PCR反應(yīng)檢測(cè)以及各種特異性的病原微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)等。這些技術(shù)在日常病原微生物確證中發(fā)揮了重要作用,但也存在一定的不足,如前者需要依賴培養(yǎng)、周期長(zhǎng)、鑒定精度低,后者需要一定的微生物序列先驗(yàn)知識(shí)、無法應(yīng)對(duì)未知或突變病原體等。隨著新一代測(cè)序(Next Generation Sequencing,NGS)技術(shù)的出現(xiàn)和迅猛發(fā)展,其在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究各個(gè)領(lǐng)域中都開始發(fā)揮重要作用,且有進(jìn)入臨床一線工作的趨勢(shì)。在分子診斷領(lǐng)域,采用新一代測(cè)序技術(shù),對(duì)不經(jīng)過培養(yǎng)的樣本進(jìn)行直接鑒定,發(fā)現(xiàn)其他技術(shù)無法確證病原體的,已經(jīng)成為可能并有多篇文獻(xiàn)報(bào)道。在面對(duì)突發(fā)疫情和臨床未知病原體診斷上,新一代測(cè)序技術(shù)比傳統(tǒng)方法更具有優(yōu)勢(shì),它無需培養(yǎng)、無需微生物序列先驗(yàn)知識(shí)、可以提供更多病原體基因組信息等。因此,建立新突發(fā)“未知”病原微生物確證及溯源技術(shù)平臺(tái),有利于迅速開展針對(duì)重大公共衛(wèi)生安全事件的各項(xiàng)防控和醫(yī)療應(yīng)對(duì)措施�；诖�,我們?cè)O(shè)計(jì)研究并建立了基于高通量測(cè)序平臺(tái)和高性能計(jì)算平臺(tái)的未知病原體檢測(cè)系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了對(duì)非培養(yǎng)臨床樣本的直接高通量測(cè)序和病原體診斷。該系統(tǒng)彌補(bǔ)了臨床病原微生物鑒定中傳統(tǒng)方法難以解決的問題,具有樣品無需培養(yǎng)、無需病原體基因組先驗(yàn)知識(shí)、所需起始核酸量較少、高分辨率和高精確度以及提供更多病原體基因組信息等優(yōu)點(diǎn)。高通量測(cè)序平臺(tái)包括了hiseq2500測(cè)序儀與miseq測(cè)序儀為主要基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)室病原體測(cè)序平臺(tái),和iontorrentpgm測(cè)序儀為主的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)序平臺(tái),并已完成對(duì)超過1000例樣本的測(cè)序。高性能計(jì)算平臺(tái)擁有峰值運(yùn)算速度不小于20萬億次/每秒的計(jì)算系統(tǒng)、容量不小于500tb的高可靠存儲(chǔ)。我們還在平臺(tái)上部署了重要病原體和宿主的核酸數(shù)據(jù)庫,為測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)、基因組組裝、分型、耐藥性分析等提供基礎(chǔ),并且研發(fā)了未知病原微生物快速確證等軟件分析流水線。最后對(duì)該平臺(tái)進(jìn)行了性能檢測(cè),其計(jì)算能力突出,加速效率顯著。臨床樣本測(cè)序過程中,如何對(duì)樣本進(jìn)行科學(xué)合理的預(yù)處理以提高病原體檢測(cè)效率目前還沒有清晰的認(rèn)識(shí)。我們?cè)O(shè)計(jì)研究了在非培養(yǎng)臨床標(biāo)本rna的處理過程中,去除rrna和mrna以及cdna擴(kuò)增放大對(duì)后續(xù)測(cè)序結(jié)果特別是對(duì)病原體鑒定能力的影響。將人的rna和甲型流感病毒(h1n1)的rna混合作為一個(gè)模型,對(duì)該模擬樣本進(jìn)行高通量測(cè)序,通過生物信息學(xué)分析比較不同實(shí)驗(yàn)預(yù)處理方法下的病原體基因組復(fù)原效率,發(fā)現(xiàn)對(duì)非培養(yǎng)樣品核酸進(jìn)行直接測(cè)序是從樣品中鑒定未知病原體的最優(yōu)策略,它不僅能夠準(zhǔn)確鑒定和分型,還將產(chǎn)生最大的基因組覆蓋度、最小的覆蓋偏性和最高效的基因組復(fù)原效率。直接測(cè)序的方法,相比于去除背景核酸、dna擴(kuò)增放大和很多其它方法,其實(shí)驗(yàn)操作較為簡(jiǎn)單,無需經(jīng)過特殊處理,這意味著更少的實(shí)驗(yàn)流程、更低廉的費(fèi)用、更低的技術(shù)錯(cuò)誤率和更少的實(shí)驗(yàn)周期,所以我們建議對(duì)非培養(yǎng)臨床樣本進(jìn)行直接測(cè)序檢測(cè)未知病原體。在生物信息學(xué)分析方面,雖然已有許多功能相近的軟件工具和工作流程,但是目前缺乏對(duì)已有生物信息學(xué)分析軟件的綜合比較評(píng)價(jià)。我們研究了在應(yīng)用ngs技術(shù)從非培養(yǎng)樣本中鑒定未知病原微生物時(shí),不同數(shù)據(jù)分析軟件的表現(xiàn),最終給出它們的整體評(píng)價(jià),并根據(jù)具體應(yīng)用條件作出最佳方案選擇。一般在測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量比較好的情況下,含拼接的分析流程比不拼接的分析流程表現(xiàn)好。當(dāng)樣品中含有新穎病原體或者新序列時(shí),不依賴于任何病原體基因組序列的denovo拼接流程則比較是適用。當(dāng)通過拼接無法獲得任何病原體序列時(shí),則需要使用與微生物數(shù)據(jù)庫比對(duì)過濾的流程,通過富集微生物核酸序列鑒定未知病原體。當(dāng)樣品中核酸主要來自于宿主時(shí),需要在前期對(duì)宿主核酸序列進(jìn)行對(duì)比過濾。最后我們?cè)O(shè)計(jì)采用高通量測(cè)序的方法,對(duì)18例頭頸癌(headandneckcancer,hnc)組織樣本及癌旁組織樣本同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)了齒垢密螺旋體(Treponema denticola)在腫瘤和癌旁中表達(dá)存在顯著差異,暗示了它有可能是與頭頸癌相關(guān)潛在的微生物或標(biāo)志物,需要更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。該案例作為一個(gè)檢驗(yàn)未知病原微生物檢測(cè)系統(tǒng)的研究,佐證了我們建立的基于高通量測(cè)序平臺(tái)的未知病原微生物檢測(cè)系統(tǒng)是成功有效的。我們的研究和評(píng)估結(jié)果將有助于指導(dǎo)以后的臨床病原微生物鑒定分析工作,提高未知病原體鑒定的準(zhǔn)確性和科學(xué)性,將有助于我們未來應(yīng)對(duì)突發(fā)疫情時(shí)做出迅疾反應(yīng)和解決臨床疑難診斷問題,將有助于更好地為人類生命健康安全服務(wù)。
[Abstract]:In recent years , there have been more and more serious diseases caused by new outbreaks of pathogenic microorganisms , such as SARS ( severe acute respiratory syndrome ) coronavirus , avian influenza in 2006 , influenza A ( H1N1 ) in 2006 . In order to improve the efficiency of genome restoration , it is not only possible to accurately identify and classify the RNA of human RNA and influenza A virus ( h1n1 ) . We have found that there is a significant difference in the expression of Trematodenticola in tumor and cancer . It suggests that it may be a potential microorganism or marker related to head and neck cancer , and more experiments need to be verified . The results of our research and evaluation will help guide future clinical pathogenic microorganism identification and analysis work , improve the accuracy and scientific nature of the identification of unknown pathogens , and will help us to respond quickly to sudden outbreak and resolve clinical difficult diagnosis problems , which will help to better serve the health and safety of human life .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R440;Q811.4

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