本文選題：角蛋白酶 + 嗜麥芽窄食單胞菌��； 參考：《江南大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：角蛋白酶(keratinase)是一種可以特異性降解角蛋白底物的水解酶,在飼料、洗滌、皮革以及醫(yī)藥行業(yè)有著巨大的潛在應(yīng)用價值。但目前角蛋白酶產(chǎn)量低和酶學(xué)性質(zhì)差,嚴(yán)重阻礙了角蛋白酶的商業(yè)化開發(fā)和工業(yè)化應(yīng)用。為實現(xiàn)角蛋白酶工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用,本研究篩選獲得一株能高效降解羽毛廢棄物的嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1,通過搖瓶和發(fā)酵罐發(fā)酵水平的優(yōu)化,提高角蛋白酶產(chǎn)量,并對酶進(jìn)行純化和酶學(xué)性質(zhì)解析;在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步鑒定角蛋白酶基因,構(gòu)建其異源表達(dá)系統(tǒng),通過理性改造提高角蛋白酶性能。主要研究成果如下:(1)角蛋白酶生產(chǎn)菌的篩選和發(fā)酵優(yōu)化從無錫市馬山家禽養(yǎng)殖場篩選得到一株以羽毛作為唯一碳氮源的S.maltophilia BBE11-1,在其發(fā)酵液中測得明顯的角蛋白酶活力。在搖瓶水平上,通過單因素、Plackett Burma及響應(yīng)面分析等實驗,確定發(fā)酵培養(yǎng)基為:1.5 g?L-1天冬氨酸,1.45 g?L-1大豆蛋白胨,4.25 g?L-1葡萄糖,10 g?L-1羊毛,1 g?L-1 K2HPO4,1 g?L-1 KH2PO4,1 g?L-1 Na Cl,100μl?L-1吐溫20,初始p H 9.0,23°C,200 rpm搖床培養(yǎng)48 h。在3 L罐中,采取多種發(fā)酵策略(溫度轉(zhuǎn)化策略、溶氧控制策略和葡萄糖流加策略),S.maltophilia的角蛋白酶活力由優(yōu)化前的145.2 U?ml-1提高到1282.7 U?ml-1,發(fā)酵時間從48小時縮短到18小時。將上述發(fā)酵過程放大至30 L罐,發(fā)酵18小時角蛋白酶活力達(dá)到1728 U?ml-1,比搖瓶水平的生產(chǎn)力提高32倍。此外,發(fā)酵液中必需氨基酸含量較高,具有開發(fā)有機(jī)肥料或者飼料添加劑的潛力。(2)角蛋白酶分離純化及性質(zhì)解析S.maltophilia發(fā)酵上清液依次經(jīng)疏水柱、離子交換柱及凝膠柱純化,分離得到三種和角蛋白降解相關(guān)的蛋白,其中兩種蛋白具有角蛋白酶活性,分別命名為Ker SMD和Ker SMF。蛋白質(zhì)N端測序分析顯示,Ker SMD和Ker SMF的N端氨基酸序列分別為LAPNDPYYQQ和LTPNDTRFSE。基于S.maltophilia基因密碼子偏好性,根據(jù)N端氨基酸序列設(shè)計簡并引物,采用熱不對稱PCR方法篩選得到S.maltophilia BBE11-1基因組中的角蛋白酶基因ker SMD(1905 bp)和ker SMF(1743 bp)。以p ET質(zhì)粒為載體,將上述角蛋白酶基因表達(dá)于大腸桿菌BL21(DE3),在重組菌上清液中均檢測到角蛋白酶活性。其中Ker SMD的角蛋白酶活性是Ker SMF的三倍;Ker SMD在50?°C半衰期是Ker SMF的9倍,所以Ker SMD更加穩(wěn)定。(3)角蛋白酶C端結(jié)構(gòu)功能解析蛋白酶的C端結(jié)構(gòu)往往和底物特異性相關(guān),本研究還發(fā)現(xiàn)角蛋白酶Ker SMD的C端結(jié)構(gòu)具有自我剪切特性。為研究C端結(jié)構(gòu)對酶學(xué)性質(zhì)的影響,以β-折疊的二級結(jié)構(gòu)為單位對C端進(jìn)行逐步缺失,分別得到突變體V456,V455,V435,V415,V395,V380,V370和V355。發(fā)現(xiàn)整個C端缺失的突變體V355對膠原蛋白降解活性低,在強(qiáng)堿(p H12)下表現(xiàn)出40%的相對酶活,在高鹽(15%,w/v)環(huán)境下表現(xiàn)出60%的相對酶活,以及在高濃度(4%,w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)下表現(xiàn)出48%的殘余酶活,在洗滌劑和皮革加工中具有較大應(yīng)用潛力。V380、V370和V355在60?°C下的角蛋白酶活性提高1.7倍;其中V456在60°C下保溫90 min擁有將近70%的酶活,較野生酶提高20%。模擬結(jié)構(gòu)分析表明,V456的催化中心位點的空間距離和氫鍵數(shù)量都變少,可能增強(qiáng)了催化三聯(lián)體的相互作用力從而增加了該突變體的熱穩(wěn)定和嗜熱性;V355催化三聯(lián)體上端形成的弱負(fù)電荷環(huán)狀結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了催化活性中心與SDS的靜電斥力,可能是SDS耐受力增強(qiáng)的重要原因。上述結(jié)果表明,C端結(jié)構(gòu)可通過調(diào)節(jié)催化活性中心的作用力來影響Ker SMD底物特異性以及抗逆性能。(4)結(jié)構(gòu)域重組提高角蛋白酶Ker SMD催化活性及熱穩(wěn)定性氨基酸序列比對和蛋白模擬結(jié)構(gòu)分析顯示Ker SMD和Ker SMF具有獨立的N端前導(dǎo)肽和C端結(jié)構(gòu)。采用N/C端結(jié)構(gòu)域重組的策略,構(gòu)建并成功獲得基于Ker SMD催化區(qū)域的突變體DDF、FDD、FDF、DD和FD。與野生酶相比,DDF比酶活(角蛋白酶活性)提高500多單位,達(dá)到3909±45 U?mg-1,催化速率kcat/Km也增長54.5%。FDF60°C半衰期達(dá)到244.6?±?2 min的,是野生型的5.9倍;此外,FDF在p H 8.0-12.0條件下的活性比野生酶提高了12%,上述性質(zhì)有助于FDF在皮革以及洗滌劑等行業(yè)的應(yīng)用。蛋白模擬結(jié)構(gòu)顯示新的結(jié)構(gòu)域的引入主要改變了底物結(jié)合口袋形態(tài),說明角蛋白酶C端結(jié)構(gòu)可以調(diào)節(jié)底物結(jié)合口袋大小來影響角蛋白酶的底物催化特性;而N端前導(dǎo)肽則是通過輔助蛋白折疊和加速成熟的特殊功能來實現(xiàn)角蛋白酶的高催化活性和熱穩(wěn)定性。(5)分子改造S1口袋提高Ker SMD催化活性根據(jù)以上研究,發(fā)現(xiàn)Ker SMD的催化活性與底物結(jié)合口袋S1構(gòu)象變化有關(guān)。晶體結(jié)構(gòu)和氨基酸序列分析顯示,S1口袋中主要存在四個差異氨基酸(Ser180、Glu208、Tyr215和Arg216),對其疏水性或者側(cè)鏈短小氨基酸的定點突變,發(fā)現(xiàn)Tyr215位點對于Ker SMD的催化活性影響最大,其中Y215G表現(xiàn)出最高催化速率(365 s-1·m M-1)。然后對Tyr215位點進(jìn)行飽和突變,發(fā)現(xiàn)合適的側(cè)鏈空間體積和疏水性有助于Ker SMD催化活性的提升。為進(jìn)一步優(yōu)化S1口袋構(gòu)象,對三個位點Ser180,Glu208和Tyr215進(jìn)行組合突變:S180G/Y215S表現(xiàn)出最高角蛋白酶活性(4800±138 U?mg-1);突變體S180G/Y215A的K:C比值(角蛋白比酶活:酪蛋白比酶活)為所有突變體中的最大值,將近4.5。另外,還檢測到Y(jié)215S,Y215G和S180G/Y215S具有嗜熱性,其中Y215S在70°C下角蛋白比酶活(7000 U·mg-1)比野生酶提高了2倍。蛋白模擬結(jié)構(gòu)顯示,合適的S1口袋大小和疏水性可以促進(jìn)角蛋白酶水解能力。采用大腸桿菌對角蛋白酶突變體S180G/Y215S進(jìn)行高效表達(dá)和發(fā)酵條件研究,采用碳源流加和生長后期誘導(dǎo)策略,從搖瓶的400 U?ml-1酶活提升到3 L發(fā)酵罐中的4500 U?ml-1,比原始產(chǎn)量提升了11.25倍。
[Abstract]:瑙掕泲鐧介叾(keratinase)鏄竴縐嶅彲浠ョ壒寮傛，

本文編號：1818828