本文關(guān)鍵詞：利用煙草和豌豆瞬時表達(dá)抗aFGF單鏈抗體，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

網(wǎng)友小博士近日為您收集整理了關(guān)于利用煙草和豌豆瞬時表達(dá)抗aFGF單鏈抗體的文檔，希望對您的工作和學(xué)習(xí)有所幫助。以下是文檔介紹：利用煙草和豌豆瞬時表達(dá)抗aFGF單鏈抗體第一章前言1.單鏈抗體的研究進(jìn)展抗體antibody,Ab)是動物免疫系統(tǒng)受到抗原刺激后,由B淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞分泌合成的一類能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白immunoglobulin,Ig)�？贵w是動物最重要的免疫系統(tǒng)組成部分之一。所有的抗體都具有共同的4條多肽鏈結(jié)構(gòu):兩條完全相同的重鏈H)和兩條完全相同的輕鏈L),通過二硫鍵連接在一起[16]。4條多肽鏈在羧基和氨基的末端分別包括恒定區(qū)C)和可變區(qū)V),重鏈H)和輕鏈L)的可變區(qū)通過它們的第一個恒定區(qū)C)結(jié)合在一起,形成兩個完成相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)Fab)�？贵w的效應(yīng)功能,如抗原依賴的細(xì)胞***是由可結(jié)晶區(qū)Fc)結(jié)構(gòu)調(diào)解的[17]。最近,植物生物反應(yīng)器在藥用蛋白表達(dá)的研究上取得了長足的進(jìn)展。植物系統(tǒng)能夠有效對重組蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的合成、加工,維持正確的蛋白構(gòu)象,保證生物學(xué)功能不受影響。利用植物生產(chǎn)的藥用蛋白生產(chǎn)成本低,易于純化,且表達(dá)策略靈活多樣,與原核表達(dá)系統(tǒng)相比具有極大的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景。尤其是基于植物病毒載體的瞬時表達(dá)系統(tǒng),具有表達(dá)周期短,蛋白表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn),極有希望成為價值蛋白的主要來源及生產(chǎn)方法[13-15]。基于此,本研究在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上,開展了抗aFGF單鏈抗體在植物中瞬時表達(dá)的研究工作,期望建立一種安全、高效、易于規(guī)模化生產(chǎn)的單鏈抗體瞬時表達(dá)系統(tǒng),為小分子抗體藥物科學(xué)研究及規(guī)�；a(chǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1.2抗體的幾個發(fā)展階段自1890年,Kitasato等[18]第一次描述抗白喉和破傷風(fēng)***抗體的免疫活性以來,大量的科學(xué)家把研究興趣集中在對抗體的結(jié)構(gòu)和功能探索的研究上。1975年,Khler和Milstein發(fā)展了雜交瘤技術(shù)[19],制備了�；愿鼜�(qiáng)的單克隆抗體mAbs)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),目前已有36種治療型單克隆抗體在歐盟被核準(zhǔn)。單克隆抗體與相應(yīng)抗原具有高度的特異性及極強(qiáng)的結(jié)合能力,能夠選擇性消除腫瘤細(xì)胞并且維持一定的細(xì)胞毒性,為腫瘤治療開辟了一條新的途徑。近年來,單克隆抗體藥物在腫瘤靶向治療上的應(yīng)用得到迅速發(fā)展,在腫瘤臨床治療上發(fā)揮越來越重要的作用。但是,在發(fā)展的同時也存在一些問題與不足:目前采用的單克隆抗體多是鼠源性,當(dāng)用于人體極易引起人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng),伴隨強(qiáng)烈的致敏反應(yīng),產(chǎn)生一定的毒副作用[20];另外,由于腫瘤的間質(zhì)內(nèi)壓要高于正常組織,單克隆抗體又多是生物大分子,無法在腫瘤靶向部位大量攝取,降低了單克隆抗體對腫瘤的抑制作用[21]。為了解決單克隆抗體存在的問題,人們對抗體分子進(jìn)行了改造和修飾,產(chǎn)生了第三代抗體——基因工程抗體。其中,單鏈抗體scFv)作為基因工程抗體的重要發(fā)展方向,具有單克隆抗體無法比擬的優(yōu)勢,受到人們的廣泛關(guān)注[22-26]。..第二章抗aFGF單鏈抗體在煙草和豌豆中的瞬時表達(dá)1.材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1植物材料野生型煙草Nicotianabenthamiana)種子,b博士惠贈;豌豆種子購自吉林省農(nóng)業(yè)高新技術(shù)研究開發(fā)有限公司。1.1.2菌種和質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株:EHA105和GV3101均由本實(shí)驗(yàn)室保存。EHA105選擇標(biāo)記為利福平抗性,GV3101選擇標(biāo)記為利福平和四環(huán)素抗性帶有一個伴隨因子質(zhì)粒pJICSA_Rep)。大腸桿菌菌株:DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存,用于陽性克隆的篩選和質(zhì)粒的保存、擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。pET-28a-scFv質(zhì)粒:由本實(shí)驗(yàn)室保存,scFv目的片段長度為741bp。p35S-30B-GFP質(zhì)粒:由中科院微生物研究所方榮祥教授實(shí)驗(yàn)室惠贈。該載體將煙草花葉病毒TMV)30B的cDNA序列置于35S啟動子和NOS終止子之間,再將整個病毒cDNA表達(dá)框克隆到pCambia1300載體中,構(gòu)建成p35S-30B載體。為了便于基因表達(dá)觀察,在30B載體病毒移動蛋白的下游引入GFP綠色熒光蛋白)報告基因,構(gòu)成p35S-30B-GFP載體,選擇標(biāo)記是卡那霉素抗性。p35S-30B-scFv質(zhì)粒:由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存,是以p35S-30B載體為骨架構(gòu)建而成。在scFv基因的5‘端引入PacI酶切位點(diǎn)和6個組氨酸序,3’端引入KDEL序列和XhoI酶切位點(diǎn),長度約850bp。pCAPE1和pCAPE2-GFP質(zhì)粒:由丹麥農(nóng)科院Constantin博士惠贈。PEBV病毒是一種雙鏈RNA病毒,包括RNA1和RNA2兩條鏈。其中RNA1鏈編碼與病毒復(fù)制和運(yùn)動有關(guān)的蛋白,RNA2鏈編碼衣殼蛋白。該載體將PEBV病毒RNA1和RNA2鏈的cDNA序列分別插入到pCambia1300載體的左右邊界之間,轉(zhuǎn)錄元件被35S啟動子和NOS終止子控制。pCAPE1包含PEBV病毒RNA1鏈的全長cDNA序列,為了保證質(zhì)粒在細(xì)菌中的穩(wěn)定性插入了一個內(nèi)含子。pCAPE2-GFP包含PEBV病毒RNA2鏈的cDNA序列,GFP基因取代了病毒基因組中線蟲運(yùn)輸所需的基因。pCAPE1和pCAPE2-GFP質(zhì)粒的選擇標(biāo)記是卡那霉素抗性。2.結(jié)果與分析活化含有煙草花葉病毒TMV瞬時表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105-p35S-30B-GFP和EHA105-p35S-30B-scFv,在固體LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),分別挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。以GFP-F和GFP-R為引物,煮沸的單菌落作為模板,擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果在717bp處出現(xiàn)1條特異性條帶圖2-3),與GFP基因預(yù)期大小相一致,證明保存的EHA105菌種中含有陽性載體質(zhì)粒。本實(shí)驗(yàn)室保存的p35S-30B-scFv載體是以p35S-30B-GFP載體為骨架,利用帶有KDEL信號肽序列的scFv基因替換GFP基因所得,長度約850bp。利用引物p35S-30B-F和p35S-30B-R對保存的陽性菌種進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果在850bp左右出現(xiàn)特異性條帶圖2-4),符合預(yù)期結(jié)果,可以用于后續(xù)植物侵染實(shí)驗(yàn)。.第三章豌豆芽苗菜新型植物瞬時表達(dá)...........391.材料與方法.......391.1實(shí)驗(yàn)材料...........391.2實(shí)驗(yàn)方法...........392.結(jié)果與分析.......442.1豌豆芽苗菜外源蛋白瞬時表達(dá)體系的建立...........442.2豌豆芽苗菜外源蛋白瞬時表達(dá)體系的優(yōu)化...........462.3豌豆中GFP基因的表達(dá)檢測..........492.4抗aFGF-scFv在豌豆芽苗菜中的瞬時表達(dá)...........512.5豌豆芽苗菜表達(dá)抗aFGF-scFv蛋白的生物學(xué)活性分析.......523.討論...........533.1豌豆芽苗菜外源蛋白瞬時表達(dá)體系的建立和優(yōu)化.......533.2豌豆芽苗菜中GFP基因表達(dá)量分析......543.3抗aFGF-scFv在豌豆芽苗菜中的表達(dá)及活性分析.......553.討論為了克服葉片注射法操作費(fèi)時費(fèi)力,侵染效率低下等問題,本研究利用真空侵染技術(shù)在豌豆芽苗菜中瞬時表達(dá)外源蛋白,旨在建立一種安全、高效的蛋白表達(dá)新體系,提高

12>

  本文關(guān)鍵詞：利用煙草和豌豆瞬時表達(dá)抗aFGF單鏈抗體，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。