本文選題：ARAP3 + GTP酶激活蛋白質(zhì)�。� 參考：《中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：本論文的第一章介紹了我們關(guān)于含有兩個(gè)GTP酶激活蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的人源蛋白質(zhì)ARAP3選擇性識(shí)別RhoA的結(jié)構(gòu)與功能研究。ARAP3是一個(gè)多結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),它含有1個(gè)ArfGAP結(jié)構(gòu)域、1個(gè)RhoGAP結(jié)構(gòu)域、1個(gè)SAM結(jié)構(gòu)域、5個(gè)PH結(jié)構(gòu)域、以及1個(gè)RA結(jié)構(gòu)域。ARAP3的特點(diǎn)是同時(shí)擁有兩個(gè)具有活性的GTP酶激活蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域,其中ArfGAP可以選擇性地識(shí)別并加速Arf6-GTP水解為Arf6-GDP,RhoGAP可以選擇性地識(shí)別并加速RhoA-GTP水解為RhoA-GDP。PtdIns(3,4,5)P3與 ARAP3 的結(jié)合可以提高 ArfGAP 的活性,Rap1-GTP與ARAP3的結(jié)合可以提高RhoGAP的活性。ARAP3很多生物學(xué)功能都與它的RhoGAP結(jié)構(gòu)域的活性有關(guān),如參與板狀偽足的形成、參與血管生成、抑制硬胃癌細(xì)胞的腹膜擴(kuò)散、調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的趨化性和粘附相關(guān)過(guò)程、以及參與神經(jīng)突生長(zhǎng)等。為了更清晰的了解ARAP3是如何特異性識(shí)別RhoA,我們解析了 ARAP3的RhoGAP結(jié)構(gòu)域與RhoA·GDP·AlF4-在反應(yīng)過(guò)渡態(tài)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。ARAP3的RhoGAP結(jié)構(gòu)域由9個(gè)長(zhǎng)的α螺旋和2個(gè)短的α螺旋反向平行折疊組成。我們對(duì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)提供的作用界面上的氨基酸進(jìn)行突變,并通過(guò)細(xì)胞外1TC實(shí)驗(yàn)以及酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究了這些氨基酸對(duì)RhoGAP結(jié)構(gòu)域識(shí)別RhoA以及加速RhoA-GTP水解能力的影響。我們發(fā)現(xiàn)對(duì)ARAP3的氨基酸的Arg-942、Arg-949、Arg-982或Arg-985的單點(diǎn)突變都可以顯著的降低ARAP3-RhoGAP結(jié)構(gòu)域與RhoA-GTP的結(jié)合能力以及GAP活性。我們還發(fā)現(xiàn)ARAP3是通過(guò)RhoA的α3螺旋中的氨基酸Asp-90和Glu-97來(lái)選擇RhoA作為特異性作用底物的。本論文的第二章介紹了我們關(guān)于擬南芥中的PUF蛋白質(zhì)APUM23特異性識(shí)別18S核糖體RNA中11個(gè)核苷酸的5'-GGAAUUGACGG-3'序列的結(jié)構(gòu)與功能研究。多年來(lái)PUF蛋白質(zhì)得到了廣泛的結(jié)構(gòu)與功能研究,但是我們對(duì)植物中的PUF蛋白質(zhì)仍然知之甚少。大部分的PUF蛋白質(zhì)都存在于細(xì)胞質(zhì)中,它們通過(guò)結(jié)合信使RNA的3'非翻譯區(qū)來(lái)調(diào)控信使RNA的翻譯及定位。APUM23是少數(shù)的存在于核仁中的PUF蛋白質(zhì),它參與調(diào)節(jié)前核糖體RNA的加工過(guò)程,然而其中的分子機(jī)制目前尚不清楚。我們解析了 APUM23和目的RNA的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),這是第一個(gè)解析出的植物中的PUF蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),APUM23是由10個(gè)Puf repeat串聯(lián)結(jié)構(gòu)域折疊成的C型結(jié)構(gòu),APUM23有一段插入序列并在C型結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)折疊成α螺旋。這段插入序列參與RNA的識(shí)別。最后,我們還解析了不含插入氨基酸序列的APUM23的突變體和RNA 5'-GGAAUUGACGG-3'的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。這個(gè)復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示,Go的堿基不再與APUM23的第十個(gè)Puf repeat結(jié)構(gòu)域結(jié)合,而是經(jīng)過(guò)大角度的翻轉(zhuǎn)和A-3的堿基形成堆積相互作用穩(wěn)定A+3堿基的構(gòu)象。插入氨基酸序列的存在會(huì)通過(guò)空間位阻限制Go堿基的翻轉(zhuǎn),因此APUM23的插入氨基酸序列既識(shí)別RNA的堿基,又可以穩(wěn)定RNA的構(gòu)象。這項(xiàng)工作揭示了APUM23特異性識(shí)別18S核糖體RNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
[Abstract]:In the first chapter of this thesis, we introduce our research on the structure and function of ARAP3 selective recognition of RhoA with two GTP enzyme activated protein domains. ARAP3 is a multidomain protein. It contains one ArfGAP domain, one RhoGAP domain, one SAM domain, five PH domains, and one RA domain. ARAP3 is characterized by two active GTP enzyme activated protein domains. ArfGAP can selectively recognize and accelerate the hydrolysis of Arf6-GTP to Arf6-GDPN RhoGAP, which can selectively recognize and accelerate the hydrolysis of RhoA-GTP to RhoA-GDP.PtdInsf3 and ARAP3. It can improve the activity of ArfGAP, Rap1-GTP and ARAP3, which can improve the activity of RhoGAP. ARAP3. The function is related to the activity of its RhoGAP domain, They are involved in the formation of platelike pseudopodia, angiogenesis, inhibition of peritoneal diffusion, regulation of neutrophil chemotaxis and adhesion related processes, and involvement in neurite growth. In order to understand more clearly how ARAP3 specifically recognizes RhoA, we have analyzed the RhoGAP domain of ARAP3 and RhoA GDP AlF4- the RhoGAP domain of the complex in transition state. The RhoGAP domain of ARAP3 is composed of 9 long 偽 helix and 2 short 偽 helix reverse parallel folding. We mutated the amino acids at the interaction interface provided by the complex structure and studied the effects of these amino acids on the RhoA recognition and RhoA-GTP hydrolysis ability of the RhoGAP domain by extracellular 1TC and enzyme kinetics experiments. We found that the single point mutation of Arg-942Ag-949 Arg-982 or Arg-985 could significantly decrease the binding ability of ARAP3-RhoGAP domain to RhoA-GTP and the activity of GAP. We also found that ARAP3 selects RhoA as the specific substrate through the amino acid Asp-90 and Glu-97 in the 偽 3 helix of RhoA. In the second chapter of this thesis, we introduce the structure and function of PUF protein APUM23 in Arabidopsis thaliana, which specifically recognizes 11 nucleotides in 18s ribosomal RNA. PUF proteins have been widely studied in structure and function for many years, but we still know little about PUF proteins in plants. Most of the PUF proteins are present in the cytoplasm. They regulate the translation and localization of messenger RNA by binding the 3'untranslated region of messenger RNA. APUM23 is a small number of PUF proteins in nucleoli. It is involved in the processing of pre-ribosomal RNA. However, the molecular mechanism is unclear. We have elucidated the crystal structure of the complex of APUM23 and RNA. This is the first elucidated PUF protein structure in plants, APUM23 is a C-type structure folded from 10 Puf repeat tandem domains with an insert sequence and folded into a helix inside the C-type structure. This insert sequence is involved in the identification of RNA. Finally, the crystal structure of the APUM23 mutant and the complex of RNA 5G GGAAUGACGG-3 'without the insertion amino acid sequence were analyzed. The structure of the complex shows that the base of Go is no longer bound to the tenth Puf repeat domain of APUM23, but the conformation of A 3 is stabilized by large angle reversal and stacking interaction of A-3 bases. The existence of inserted amino acid sequence will limit the turnover of go base by steric hindrance, so the inserted amino acid sequence of APUM23 can not only recognize the base of RNA, but also stabilize the conformation of RNA. This work reveals the structural basis of APUM23 specific recognition of 18 S ribosomal RNA.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：Q51;Q78

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本文編號(hào)：1791861