本文關(guān)鍵詞：小麥穗部病毒誘導(dǎo)基因沉默體系的建立及籽粒大小相關(guān)基因TaCYP78A3和TaCYP78A5的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《西北農(nóng)林科技大學(xué)》 2016年

Tae-miR9677前體及其小串聯(lián)模擬靶標(biāo)表達(dá)載體構(gòu)建及小麥遺傳轉(zhuǎn)化研究

李趙杰  

【摘要】：miRNA在植物的生長、發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答等各種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。近年來,植物miRNA的鑒定及功能研究已成為熱點(diǎn)研究領(lǐng)域,然而小麥作為重要的糧食作物,其miRNA功能研究卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于其他植物,這種情況亟待解決。為揭示本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的小麥穗部特異性高表達(dá)Tae-miR9677的相關(guān)功能,本研究首先通過分離克隆或人工合成分別獲得Tae-miR9677前體(Tae-pre-miR9677)及其小串聯(lián)模擬靶標(biāo)(Tae-miR9677 STTM)序列,并將其連接在改造后的雙元表達(dá)載體pCAMBIA3301上,分別獲得了以Ubiqutin(UBI)啟動(dòng)子啟動(dòng)的Tae-pre-miR9677及Tae-miR9677STTM的表達(dá)載體pCAMBIA3301-Tae-pre-miR9677和pCAMBIA3301-Tae-miR9677 STTM;利用基因槍轉(zhuǎn)化法和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入受體小麥綿陽19,獲得轉(zhuǎn)基因陽性小麥株系,為后續(xù)利用轉(zhuǎn)基因小麥株系研究Tae-miRNA 9677的功能奠定基礎(chǔ)工作。研究主要結(jié)果如下:(1)Tae-miR9677 STTM過表達(dá)載體構(gòu)建及小麥遺傳轉(zhuǎn)化本實(shí)驗(yàn)首先設(shè)計(jì)并人工合成得到兩端帶有BamHⅠ、PmlⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)的Tae-miR9677 STTM序列,通過基因重組技術(shù)改造雙元表達(dá)載體pCAMBIA3301,獲得以UBI啟動(dòng)的Tae-miR9677 STTM表達(dá)載體pCAMBIA3301-Tae-miR9677 STTM。該載體除攜帶以UBI啟動(dòng)子控制的Tae-miR9677 STTM外,還具有一個(gè)受CAMV35S啟動(dòng)子控制的Bar基因,后者可以為后續(xù)利用除草劑Phosphinothricin(PPT)對(duì)愈傷組織進(jìn)行篩選及再生植株的抗性鑒定提供了條件。通過基因槍轉(zhuǎn)化法轟擊受體小麥綿陽19幼胚愈傷共3683個(gè),經(jīng)過PPT篩選培養(yǎng)及分化培養(yǎng),最終獲得42株再生植株。利用目標(biāo)序列特異性引物進(jìn)行PCR檢測,鑒定出陽性植株8株,轉(zhuǎn)化率為0.21%;8株T0代陽性植株共收獲種子27粒T0代種子。將27粒T0代種子全部萌發(fā),成苗后獲27株T1代植株,對(duì)其進(jìn)行目標(biāo)序列特異PCR鑒定,多次重復(fù)鑒定獲得3株轉(zhuǎn)基因T1代陽性植株;同時(shí),對(duì)27株T1代植株用Basta溶液進(jìn)行檢測,同樣,只有3株P(guān)CR檢測為陽性的T1代植株對(duì)Basta溶液表現(xiàn)出抗性反應(yīng),這2種檢測相互印證,表明本研究得到了3株T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株。(2)Tae-pre-miR9677過表達(dá)載體構(gòu)建及小麥遺傳轉(zhuǎn)化本實(shí)驗(yàn)首先設(shè)計(jì)特異引物克隆得到兩端帶有BamHⅠ、PmlⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)的pre-Tae-miR9677序列,通過基因重組技術(shù)改造雙元表達(dá)載體pCAMBIA3301,獲得以UBI啟動(dòng)的Tae-pre-miR9677表達(dá)載體。該載體除攜帶以UBI啟動(dòng)子控制的Tae-pre-miR9677外,還具有一個(gè)受CAMV35S啟動(dòng)子控制的Bar基因,后者可以為后續(xù)利用除草劑Phosphinothricin(PPT)篩選轉(zhuǎn)化再生植株提供抗性。通過改造的含有過表達(dá)載體pCAMBIA3301-Tae-pre-miR9677的農(nóng)桿菌EHA105侵染受體小麥綿陽19成熟胚共1300個(gè),經(jīng)過PPT篩選,最終獲得再生植株7株,利用改造得到的過表達(dá)載體pCAMBIA3301-Tae-pre-9677特異性引物進(jìn)行PCR檢測,鑒定出陽性植株1株;對(duì)7株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Basta涂抹實(shí)驗(yàn),同樣,只有1株P(guān)CR檢測為陽性的T0代植株對(duì)Basta溶液表現(xiàn)出抗性反應(yīng),這2種檢測相互印證,表明本研究得到了1株T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

下載全文 更多同類文獻(xiàn)

CAJ全文下載

(如何獲取全文？ 歡迎：購買知網(wǎng)充值卡、在線充值、在線咨詢)

CAJViewer閱讀器支持CAJ、PDF文件格式

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王子嵐;池翠蘭;陳欣玲;王子南;杜克久;;二穗短柄草植株再生體系的建立[J];河北林果研究;2015年03期

2 程曦;王文義;邱金龍;;基因組編輯:植物生物技術(shù)的機(jī)遇與挑戰(zhàn)[J];生物技術(shù)通報(bào);2015年04期

3 李艷;許為鋼;齊學(xué)禮;李正玲;華夏;王會(huì)偉;胡琳;;提高小麥基因槍法轉(zhuǎn)化效率的研究[J];麥類作物學(xué)報(bào);2015年04期

4 池青;周鵬;劉香利;程繪繪;趙惠賢;;基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)PYL5基因小麥的獲得與鑒定[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2015年02期

5 葉興國;徐惠君;杜麗璞;何光源;王軻;林志珊;;小麥規(guī)�；D(zhuǎn)基因技術(shù)體系構(gòu)建及其應(yīng)用[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年21期

6 HAN Ran;YAN Yan;ZHOU Peng;ZHAO Hui-xian;;Comparison of Two MicroRNA Quantification Methods for Assaying MicroRNA Expression Profiles in Wheat(Triticum aestivum L.)[J];Journal of Integrative Agriculture;2014年04期

7 黃儒;蒼晶;于晶;盧寶偉;劉麗杰;王健飛;郭人銘;徐琛;;冬小麥小RNA高通量測序及生物信息學(xué)分析[J];植物學(xué)報(bào);2014年01期

8 周鵬;池青;呂金洋;劉香利;趙惠賢;;基因槍法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)KN2基因小麥的獲得及鑒定[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年01期

9 趙莎;鐘燕;蔣耀輝;易著文;;特發(fā)性矮身材兒童循環(huán)microRNA表達(dá)水平的研究[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2013年12期

10 Guiliang Tang;Xiaoqing Tang;;Short Tandem Target Mimic:A Long Journey to the Engineered Molecular Landmine for Selective Destruction/Blockage of MicroRNAs in Plants and Animals[J];Journal of Genetics and Genomics;2013年06期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 馬猛;小麥穗部病毒誘導(dǎo)基因沉默體系的建立及籽粒大小相關(guān)基因TaCYP78A3和TaCYP78A5的功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

2 韓冉;小麥不同器官/發(fā)育時(shí)期miRNA和tasiRNA的鑒定及其時(shí)空表達(dá)特征分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

3 馮浩;寄主miRNAs調(diào)控小麥與條銹菌互作的分子機(jī)理[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 程繪繪;TaCYP78A3和TaCYP78A5基因表達(dá)載體的構(gòu)建及小麥的遺傳轉(zhuǎn)化[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

2 馬猛;大麥條斑花葉病毒（BSMV）誘導(dǎo)小麥穗部基因有效沉默體系的建立[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 荊曉麗;米鐵柱;甄毓;付保忠;李成峰;于志剛;;基于瑪氏骨條藻(Skeletonema marinoi)轉(zhuǎn)錄組的氮代謝途徑解析[J];海洋環(huán)境科學(xué);2016年05期

2 程超華;臧鞏固;唐蜻;李育君;趙立寧;粟建光;;麻類作物基因工程研究進(jìn)展[J];分子植物育種;2016年07期

3 陳長明;趙祥明;雷建軍;曹必好;陳國菊;;基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Bt抗蟲基因轉(zhuǎn)化芥藍(lán)[J];中國蔬菜;2016年08期

4 李洪振;宋金鵬;劉東升;胡文剛;宮文萍;劉成;韓冉;劉建軍;;小麥miRNA研究進(jìn)展[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2016年06期

5 杜建中;郝曜山;王亦學(xué);張歡歡;孫毅;石紅衛(wèi);;我國轉(zhuǎn)基因主糧作物產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展、存在問題及對(duì)策[J];生物技術(shù)進(jìn)展;2016年03期

6 付偉;魏霜;王晨光;杜智欣;朱鵬宇;劉中勇;吳希陽;朱水芳;;基因編輯作物的發(fā)展及檢測監(jiān)管現(xiàn)狀[J];植物檢疫;2016年03期

7 賀飛燕;閆建俊;馮瑞云;張愛萍;張維鋒;白云鳳;;基因組編輯技術(shù)的原理及應(yīng)用[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào);2016年02期

8 李趙杰;簡超;劉香利;趙惠賢;;Tae-miR9677小串聯(lián)模擬靶標(biāo)(STTM)表達(dá)載體構(gòu)建及小麥的遺傳轉(zhuǎn)化研究[J];麥類作物學(xué)報(bào);2016年04期

9 平文麗;李雪君;林娟;丁燕芳;孫煥;孫計(jì)平;;CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)及其在作物品種改良中的應(yīng)用[J];中國農(nóng)學(xué)通報(bào);2016年05期

10 王梅;徐廣博;趙惠賢;劉香利;;低溫誘導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組植物表達(dá)載體構(gòu)建及小麥轉(zhuǎn)化[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2016年04期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 李趙杰;Tae-miR9677前體及其小串聯(lián)模擬靶標(biāo)表達(dá)載體構(gòu)建及小麥遺傳轉(zhuǎn)化研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

2 吳獨(dú)清;禾谷孢囊線蟲新效應(yīng)因子Ha-G20E03基因克隆及用于研究其功能的新模式系統(tǒng)的探索[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

3 牟晶晶;小麥硬脂�；d體蛋白脂肪酸去飽和酶基因(TaSSI2-1)的功能分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 南富波;病毒誘導(dǎo)的基因沉默體系優(yōu)化及小麥SBEIIb基因功能的研究[D];石河子大學(xué);2014年

【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張磊;劉新倫;田增榮;王長有;吉萬全;;小麥成熟胚基因槍轉(zhuǎn)化影響因素的研究[J];麥類作物學(xué)報(bào);2014年11期

2 WANG Xin-min;REN Xian;YIN Gui-xiang;WANG Ke;LI Jia-rui;DU Li-pu;XU Hui-jun;YE Xing-guo;;Effects of Environmental Temperature on the Regeneration Frequency of the Immature Embryos of Wheat(Triticum aestivum L.)[J];Journal of Integrative Agriculture;2014年04期

3 Zhen Liang;Kang Zhang;Kunling Chen;Caixia Gao;;Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J];Journal of Genetics and Genomics;2014年02期

4 董淼;黃越;陳文鐸;徐濤;郎秋蕾;;降解組測序技術(shù)在植物miRNA研究中的應(yīng)用[J];植物學(xué)報(bào);2013年03期

5 楊凡;;特發(fā)性矮小的診治進(jìn)展[J];中國兒童保健雜志;2013年03期

6 張會(huì);;脫落酸在植物抗性生理中的作用[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年02期

7 閔東紅;何莎;張彥;夏蘭琴;;基因槍轉(zhuǎn)化小麥主要轟擊參數(shù)的優(yōu)化[J];作物學(xué)報(bào);2013年01期

8 黨良;王愛云;徐惠君;祝秀亮;杜麗璞;邵艷軍;張?jiān)銎G;;抗根腐病的轉(zhuǎn)GmPGIP3基因小麥揚(yáng)麥18的獲得與鑒定[J];作物學(xué)報(bào);2012年10期

9 王子嵐;高品紅;魏新燕;李燕玲;杜克久;;蘆葦植株再生體系優(yōu)化[J];河北林果研究;2012年03期

10 胡帥;王芳展;劉振寧;劉亞培;余小林;;PYR/PYL/RCAR蛋白介導(dǎo)植物ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[J];遺傳;2012年05期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 羅茂;玉米抗紋枯病相關(guān)miRNA鑒定及功能分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

2 王晟;水稻小RNA的基因組分布和分子進(jìn)化研究[D];浙江大學(xué);2008年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳小霞;小麥耐熱性鑒定及熱激蛋白基因的克隆與表達(dá)分析[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

《中國學(xué)術(shù)期刊（光盤版）》電子雜志社有限公司
同方知網(wǎng)數(shù)字出版技術(shù)股份有限公司
地址：北京清華大學(xué) 84-48信箱 大眾知識(shí)服務(wù)
京ICP證040441號(hào)
互聯(lián)網(wǎng)出版許可證 新出網(wǎng)證（京）字008號(hào)
出版物經(jīng)營許可證 新出發(fā)京批字第直0595號(hào)

訂購熱線：400-819-9993 010-62982499
服務(wù)熱線：010-62985026 010-62791813
在線咨詢：
傳真：010-62780361
京公網(wǎng)安備11010802020475號(hào)

  本文關(guān)鍵詞：小麥穗部病毒誘導(dǎo)基因沉默體系的建立及籽粒大小相關(guān)基因TaCYP78A3和TaCYP78A5的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：174444