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  本文關(guān)鍵詞：西瓜果實類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因的克隆、表達與遺傳轉(zhuǎn)化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《鄭州大學(xué)》 2015年

西瓜果實類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因的克隆、表達與遺傳轉(zhuǎn)化研究

呂品  

【摘要】：類胡蘿卜素為以多個共軛的碳碳雙鍵為生色系骨架的脂肪族或脂環(huán)族類型化合物,是由植物和微生物合成的一大類色素,因具有多種醫(yī)學(xué)生物學(xué)功能而廣受關(guān)注。西瓜(Citrullus lanatus)屬于大眾化水果之一,瓜瓤所具有的紅、粉紅、黃、白等瓤色是由類胡蘿卜素組成與含量的差異所致的,研究西瓜類胡蘿卜素生物合成積累代謝,并進行遺傳操作,探討其抗腫瘤作用,可為西瓜類胡蘿卜素的開發(fā)利用,進行西瓜營養(yǎng)育種和種質(zhì)創(chuàng)新提供依據(jù)。本課題從基因水平上分析西瓜果實類胡蘿卜素合成代謝的調(diào)控機制,并建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系,試圖通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對西瓜果實類胡蘿卜素的成分進行改良。此外,本課題還對番茄紅素和β-胡蘿卜素抗腫瘤作用的分子機制進行研究。主要內(nèi)容如下:利用RT-PCR和RACE技術(shù)從西瓜果實中分離獲得牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因GGPS和八氫番茄紅素合成酶基因PSY的c DNA全長序列,并通過生物信息學(xué)方法對其核酸及推導(dǎo)的氨基酸序列進行分析。結(jié)果顯示,(1)西瓜GGPS基因c DNA序列全長1,445 bp(Gen Bank登錄號:KF914758),開放閱讀框為1,092 bp,編碼363個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量約39 k Da。西瓜GGPS氨基酸序列與同為葫蘆科的甜瓜和黃瓜GGPS的同源性高達96%和95%。預(yù)測GGPS蛋白N末端存在一段52位氨基酸組成的轉(zhuǎn)運肽信號序列。(2)西瓜PSY基因c DNA序列全長1,561 bp(Gen Bank登錄號:KC166870),開放閱讀框為1,266 bp,編碼421個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量約47.3 k Da。西瓜PSY氨基酸序列與同為葫蘆科的甜瓜和南瓜PSY的同源性分別高達95%和94%。預(yù)測PSY蛋白N末端存在一段43位氨基酸組成的轉(zhuǎn)運肽信號序列,轉(zhuǎn)運肽剪切后的PSY蛋白第209-231位氨基酸為一跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。種植四種不同瓤色的西瓜:紅瓤“CN66”、粉瓤“CN62”、黃瓤“ZXG381”和白瓤“ZXG507”,采摘收集各發(fā)育和成熟時期(授粉后6天、12天、18天、24天、30天、36天)的果實樣品,利用HPLC法檢測類胡蘿卜素的組成和含量,通過RT-q PCR技術(shù)分析類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶基因(GGPS,PSY,PSY-A,PDS,ZDS,CRTISO,LCYB,CHYB,ZEP,NCED1,NCED2和NCED3)的表達。結(jié)果顯示,紅瓤“CN66”和粉瓤“CN62”成熟果實中主要含番茄紅素,以及少量的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、δ-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素和紫黃質(zhì)。其中,番茄紅素在12 DAP時出現(xiàn),在此后的發(fā)育時期,其含量逐漸增加并成為主要的類胡蘿卜素。在18-30 DAP期間,“CN66”中大多數(shù)類胡蘿卜素合成酶基因(包括GGPS)的表達量大幅增高,而代謝酶基因NCED1和NCED2的表達量較低,導(dǎo)致該時期類胡蘿卜素的大量積累;黃瓤“ZXG381”中主要含葉黃素和紫黃質(zhì),并且在果實發(fā)育和成熟過程中,其二者含量分別與CHYB和ZEP基因的表達量呈正相關(guān);在白瓤“ZXG507”果實發(fā)育過程中,始終只能檢測到痕量的葉黃素和紫黃質(zhì),主要歸因于類胡蘿卜素合成酶基因(尤其GGPS)的表達量較低,而代謝酶基因NCED1則保持較高的表達量。該結(jié)果表明,類胡蘿卜素合成代謝相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,對不同瓤色西瓜果實中類胡蘿卜素的組成和含量具有十分重要的影響。分別構(gòu)建由西瓜果實特異性AGPL1啟動子驅(qū)動類胡蘿卜素合成相關(guān)酶基因(GGPS,PSY,LCYB)的植物表達載體,并轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中。建立西瓜品種“紅一號”的子葉體外再生體系和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系,試圖將GGPS基因轉(zhuǎn)化西瓜。結(jié)果顯示,(1)以3 d齡的無菌苗子葉為外植體,接種至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 1 mg/L+IAA 0.2 mg/L中,獲得的誘導(dǎo)率最高;最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L。(2)不定芽誘導(dǎo)階段的卡那霉素篩選濃度為75 mg/L,生根階段的篩選濃度為40 mg/L。氨芐青霉素濃度為200 mg/L或頭孢霉素濃度為300 mg/L時,對外植體的生長無明顯影響,可用于農(nóng)桿菌侵染后的脫菌和抑菌過程。外植體經(jīng)預(yù)培養(yǎng)2 d,用OD600值0.5的農(nóng)桿菌EHA105(轉(zhuǎn)入植物表達載體p AGPL1-GGPS)菌液浸染10 min,再共培養(yǎng)3 d,有利于提高遺傳轉(zhuǎn)化的效率。經(jīng)PCR檢測,初步證實GGPS基因已經(jīng)導(dǎo)入西瓜植株,轉(zhuǎn)化頻率為1.33‰。利用MTT法檢測番茄紅素和β-胡蘿卜素對人食管鱗癌細胞EC109增殖的影響,通過Western Blotting技術(shù)分析上述類胡蘿卜素對PPAR?、p21WAF1/CIP1、Cyclin D1以及Cox-2蛋白表達的影響。結(jié)果顯示,番茄紅素和β-胡蘿卜素(5-40μM)均能顯著抑制EC109細胞增殖,其抑制程度與處理濃度和時間呈正相關(guān),即呈劑量-時間依賴效應(yīng);使用3μM GW9662(PPAR?特異性抑制劑)預(yù)處理,能夠部分減弱上述類胡蘿卜素對細胞的抑制作用;番茄紅素和β-胡蘿卜素(40μM)均能顯著促進PPAR?和p21WAF1/CIP1表達,抑制Cyclin D1和Cox-2表達,而經(jīng)GW9662預(yù)處理,能夠顯著削弱上述類胡蘿卜素引起的PPAR?、p21WAF1/CIP1、Cyclin D1以及Cox-2的表達變化。該結(jié)果表明,番茄紅素和β-胡蘿卜素能通過PPARγ信號通路調(diào)控p21WAF1/CIP1和Cyclin D1的表達,干涉癌細胞周期進程,同時下調(diào)Cox-2表達,進而發(fā)揮對癌細胞增殖的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S651;Q943.2
【目錄】：

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3 田海清;西瓜品質(zhì)可見/近紅外光譜無損檢測技術(shù)研究[D];浙江大學(xué);2006年

4 王芳;西瓜壓縮及蠕變特性的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

5 劉景安;西瓜果實品質(zhì)形成的生理生化機制與基因表達譜研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

6 李敏;AM真菌對西瓜抗枯萎病的效應(yīng)及其機制[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

7 易克;西瓜遺傳圖譜的構(gòu)建及其重要農(nóng)藝性狀的基因定位[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

8 呂衛(wèi)光;上海市郊西瓜連作障礙成因及應(yīng)用生物有機肥進行防治的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 徐雪蓮;西瓜抗蚜性鑒定及其機理研究[D];海南大學(xué);2013年

10 劉娜;西瓜氮素養(yǎng)分高效吸收利用的機制研究[D];浙江大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 魏巍;西瓜振動特性及振動對其品質(zhì)影響研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 李凱;連作與輪作對砂田西瓜土壤微生物學(xué)性狀及化學(xué)性狀的影響[D];寧夏大學(xué);2015年

3 袁靜賢;生長素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族基因在西瓜果實膨大過程中的調(diào)控作用分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 楊炳艷;低溫脅迫下不同倍性西瓜基因的差異表達及表觀遺傳研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 吳宇芬;鑭對嫁接西瓜生理指標(biāo)與產(chǎn)量品質(zhì)的影響[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2008年

6 王威麟;西瓜病毒病的田間調(diào)查及多重RT-PCR同步檢測[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

7 代巧鷹;種用西瓜果肉利用技術(shù)研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 唐海東;嫁接西瓜化感效應(yīng)的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

9 崔艷玲;北京市大興區(qū)西瓜產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

10 呂飛玲;基于聲學(xué)特性的西瓜品質(zhì)無損檢測方法研究[D];浙江大學(xué);2003年

  本文關(guān)鍵詞：西瓜果實類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因的克隆、表達與遺傳轉(zhuǎn)化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：172287