本文選題：造血干細(xì)胞　切入點(diǎn)：造血干細(xì)胞前體　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：造血干祖細(xì)胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)能夠每秒再生數(shù)以百萬的血細(xì)胞,這一過程伴隨我們生命的始終。雖然造血祖細(xì)胞(hematopoietic progenitor cell,HPC)也能夠產(chǎn)生造血細(xì)胞,但是它不具備嚴(yán)格的自我更新的能力。作為整個造血系統(tǒng)的頂層設(shè)計(jì)者,只有造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSC)具有自我更新以及多向分化的能力。上世紀(jì)50年代,越來越多的研究者開始發(fā)掘HSC的表面標(biāo)志并且以多種標(biāo)志組合富集這一群體,著力通過體內(nèi)及體外的系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)將HSC的起源、發(fā)育分化、調(diào)控機(jī)制等問題研究清楚。在各種HSC標(biāo)志組合提高了其富集效率的同時,HSC的異質(zhì)性特點(diǎn)也被發(fā)現(xiàn)。簡單地說,人們通過各種標(biāo)志組合富集的HSC,也許不能反映HSC的全貌,結(jié)果只是其中的代表性HSC或者是一部分HSC亞型。那么,這使人們針對HSC的起源、發(fā)育分化、調(diào)控機(jī)制的研究更加模糊。所以,HSC的異質(zhì)性問題迫切需要解決,才能將HSC的發(fā)育與再生研究透徹。此前,國外的研究者發(fā)現(xiàn)了小鼠發(fā)育過程中胚胎第14.5天(embryonic day 14.5,E14.5)的胎肝階段至成體骨髓階段的HSC多種亞型,通過體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn),重點(diǎn)描述了E14.5胎肝階段及3周以后的骨髓階段的HSC異質(zhì)性亞型發(fā)育動力學(xué)及生理學(xué)特點(diǎn)。實(shí)際上,在胎肝最早發(fā)現(xiàn)的HSC主要由產(chǎn)生于其它生血位點(diǎn)的成熟HSC隨血液循環(huán)遷移而來�；趦�(nèi)皮造血轉(zhuǎn)化(endothelial to hematopoietic cell transition,EHT)的生血假說,即內(nèi)皮細(xì)胞是造血細(xì)胞的起源,在HSC成熟之前,不成熟的HSC也被稱之為造血干細(xì)胞前體(pre-hematopoietic stem cell,pre-HSC),分為pre-HSCⅠ類(Type 1)與pre-HSCⅡ類(Type 2)。那么,在小鼠胚胎發(fā)育早期最重要的生血位點(diǎn)——主動脈-性腺-中腎區(qū)(aortagonad-mesonephros,AGM),不成熟的pre-HSC及已經(jīng)成熟的HSC是否會包含兩種及以上的功能HSC亞型呢?是否在剛剛產(chǎn)生pre-HSC時就已經(jīng)決定了其異質(zhì)性亞型?pre-HSC和HSC的各種亞型的生物學(xué)特點(diǎn)又是什么?這些問題都還未得到明確的答案。首先,我們通過E11 AGM區(qū)新鮮細(xì)胞的極限稀釋(limit dilution assay,LDA)的直接移植,得到單克隆水平的重建受體后,收集成功重建受體的外周血,對使其重建的HSC進(jìn)行了追溯性分析。在得到的40個單克隆的HSC直接移植后長期重建的受體中,85%(34/40)的HSC表現(xiàn)為髓系相對缺陷分化的特性(γ-HSC),另外有15%(6/40)則為淋系髓系平衡型的HSC(β-HSC),未發(fā)現(xiàn)淋系相對缺陷型HSC(α-HSC)及髓系絕對缺陷型HSC(δ-HSC)。另外,在34個γ-HSC中,根據(jù)其發(fā)育動力學(xué)特性,新發(fā)現(xiàn)了少部分的在髓系分化缺陷基礎(chǔ)上的合并T淋巴細(xì)胞分化相對缺陷的γ-HSC(B-dominantγ-HSC),剩下的大部分被定義為平衡型的γ-HSC(balancedγ-HSC)。通過與國際上報(bào)道的胎肝及成體骨髓階段HSC亞型的對比,可以發(fā)現(xiàn)胚胎早期AGM區(qū)的HSC亞型構(gòu)成比例有很大不同,各個亞型的特點(diǎn)也不盡相同。其次,通過OP9-DL1共孵育后移植系統(tǒng),獲得單個pre-HSC孵育后移植重建成功的受體,同樣追溯性地發(fā)現(xiàn)了pre-HSC的亞型及特點(diǎn)。在得到的單個pre-HSC成功重建的22個受體中,55%(12/22)展示為髓系相對缺陷分化特性的pre-HSC(γ-pre-HSC),其余45%(10/22)為淋系髓系平衡型pre-HSC(β-pre-HSC)。同樣地,我們并未發(fā)現(xiàn)淋系相對缺陷型的α-pre-HSC及髓系絕對缺陷型的δ-pre-HSC。而且,在γ-pre-HSC中也出現(xiàn)了類似HSC亞型分布的B-dominantγ-pre-HSC亞型,并未發(fā)現(xiàn)pre-HSC發(fā)育階段的類型與pre-HSC亞型有對應(yīng)關(guān)系,即pre-HSC Type1與pre-HSC Type2在pre-HSC亞型分布上類似。至此,我們在單克隆和單細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)了最重要的發(fā)育位點(diǎn)AGM區(qū)的HSC及pre-HSC亞型構(gòu)成及特點(diǎn),完善了小鼠胚胎發(fā)育時間軸上的異質(zhì)性問題。在此基礎(chǔ)上,我們應(yīng)用單細(xì)胞測序技術(shù)發(fā)現(xiàn):相對于成體階段(8-12周的骨髓),胚胎階段(E11 Type 1、E11 Type 2、E14胎肝)高表達(dá)多個譜系分化相關(guān)的基因,提示胚胎階段可能是調(diào)控HSC多向分化或者決定成為不同亞型的關(guān)鍵時期。最后,我們應(yīng)用Sm22a-cre、ROSATMT、ROSAEYFP工具小鼠,在HSC發(fā)生的重要時間窗及位點(diǎn),以Sm22a-cre標(biāo)記的間質(zhì)細(xì)胞可能構(gòu)成HSC發(fā)生的微環(huán)境為結(jié)合點(diǎn),研究HSC異質(zhì)性亞型的發(fā)生機(jī)制。Sm22a雖然是平滑肌的標(biāo)志,但Sm22acre在E10.5至E11.5 AGM區(qū)及胎肝階段HSPC中均有表達(dá),在內(nèi)皮造血轉(zhuǎn)化過程中的Tpye1 pre-HSC階段,也有類似于成體骨髓中CD45+細(xì)胞的表達(dá)比例(30%左右)。然而,在分選得到的Sm22a-cre來源的內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞群體與OP9-DL1共孵育后,雖然產(chǎn)生了較豐富的造血細(xì)胞簇,但移植后卻不能成功重建受體。而且,我們分選得到的Sm22a-cre來源的間質(zhì)細(xì)胞(代表AGM區(qū)腹側(cè)微環(huán)境細(xì)胞群體),與非Sm22a-cre來源的間質(zhì)細(xì)胞(代表AGM區(qū)背側(cè)微環(huán)境細(xì)胞群體),進(jìn)行了實(shí)時熒光定量PCR分析,發(fā)現(xiàn)前者的Bmp4表達(dá)量低。最后,我們應(yīng)用HSC群體細(xì)胞移植,區(qū)分Sm22a-cre來源的骨髓HSC,在得到的成功重建受體中,未發(fā)現(xiàn)以Sm22a-cre區(qū)分的截然不同的HSC亞群特性,因此確定不能單純通過Sm22a-cre來源在骨髓HSC中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)不同的HSC的亞型。綜上,本研究首次發(fā)現(xiàn)了在小鼠胚胎發(fā)育早期重要的造血發(fā)育位點(diǎn)AGM區(qū),在內(nèi)皮造血轉(zhuǎn)化發(fā)生的時間窗內(nèi),有兩種主要的HSC亞型,主要以髓系相對缺陷型的HSC為主,并且通過pre-HSC發(fā)育成熟而來,推測HSC異質(zhì)性亞型在preHSC階段就已經(jīng)被決定了。另外HSC與pre-HSC均未發(fā)現(xiàn)淋系相對缺陷型及髓系絕對缺陷型的亞型。通過后續(xù)應(yīng)用Sm22a-cre在造血發(fā)生微環(huán)境的表達(dá),發(fā)掘E10.5-E11.5 AGM區(qū)HSC亞型發(fā)生的機(jī)制問題,無論從造血發(fā)生的空間異質(zhì)性(Sm22acre來源的內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞代表的造血發(fā)生微環(huán)境),以及時間異質(zhì)性(來源于Sm22a-cre的不同發(fā)育時間及位點(diǎn)的表達(dá)),我們并未得到滿意的答案。重要的是,通過pre-HSC的單細(xì)胞測序的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)胚胎階段相比成體階段,對于HSC異質(zhì)性亞型的調(diào)控可能更為關(guān)鍵。我們期待未來通過更深入的研究,應(yīng)用HSC表面標(biāo)志將不同亞型的HSC區(qū)分,這可能將α-HSC在胎肝階段的起源問題及pre-HSC/HSC出現(xiàn)的不同亞型的調(diào)控機(jī)制研究清楚。
[Abstract]:In the early 1950s , more and more researchers began to explore the origin , development and differentiation of HSC . There are pre - HSC type 鈪，

本文編號：1715469