本文選題：成人T淋巴細(xì)胞白血病病毒1型　切入點(diǎn)：癌蛋白Tax　出處：《江蘇大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的HTLV-1編碼的癌蛋白Tax被認(rèn)為是導(dǎo)致病毒感染后宿主細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素,本小組前期通過(guò)基因芯片分析穩(wěn)定表達(dá)癌蛋白Tax的細(xì)胞系Tax P細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)了10個(gè)高表達(dá)和38個(gè)低表達(dá)的基因,高表達(dá)基因中包括早期反應(yīng)生長(zhǎng)因子1(EGR1)。本研究旨在對(duì)Tax P細(xì)胞中EGR1的表達(dá)特性、生物學(xué)作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。方法1.EGR1在Tax蛋白陽(yáng)性細(xì)胞中的表達(dá)(1)HTLV-1陽(yáng)性T細(xì)胞中EGR1的表達(dá)選用HTLV-1陰性T細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞、MOLT4細(xì)胞;HTLV-1陽(yáng)性T細(xì)胞系MT2細(xì)胞和MT4細(xì)胞,western blot和real-time PCR檢測(cè)EGR1 m RNA和蛋白的表達(dá);(2)Tax蛋白對(duì)T細(xì)胞中EGR1表達(dá)的影響選用穩(wěn)定表達(dá)Tax蛋白的細(xì)胞系Tax P及其對(duì)照細(xì)胞系Tax N,或者通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同量的Tax質(zhì)粒,western blot和real-time PCR檢測(cè)EGR1 m RNA和蛋白的表達(dá);(3)HTLV-1感染對(duì)宿主細(xì)胞EGR1表達(dá)的影響將HTLV-1陽(yáng)性T細(xì)胞MT2與hela細(xì)胞或Jurkat按照1:5共培養(yǎng),檢測(cè)EGR1 m RNA和蛋白的表達(dá)。2.Tax蛋白陽(yáng)性細(xì)胞中EGR1表達(dá)調(diào)控特性分析(1)構(gòu)建不同長(zhǎng)度的EGR1報(bào)告基因及其突變體以jurkat細(xì)胞基因組為模板,擴(kuò)增EGR1調(diào)控序列全長(zhǎng)993bp,構(gòu)建Pgl3-EGR1-luc(E1),利用E1構(gòu)建截短體E2(-423bp~+1bp)、E3(-223bp~+1bp);委托上海生工構(gòu)建NFκB結(jié)合位點(diǎn)NBS(-422bp~-401bp)缺失和點(diǎn)突變的調(diào)控序列,分別標(biāo)記為Del E和Mut E。(2)報(bào)告基因活性分析將不同長(zhǎng)度的EGR1報(bào)告基因及其突變體,與參照載體Prl-luc和p65 sh RNA或?qū)φ蛰d體共同轉(zhuǎn)染Tax P細(xì)胞和MT2細(xì)胞,檢測(cè)EGR1調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因的相對(duì)活性。(3)HTLV-1感染對(duì)報(bào)告基因活性的影響將EGR1報(bào)告基因及其突變體,與參照載體Prl-luc和p65 sh RNA或?qū)φ蛰d體共同轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞和jurkat細(xì)胞,轉(zhuǎn)染結(jié)束后,加入1/5數(shù)量的MT2細(xì)胞,檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因的相對(duì)活性。(4)染色體共沉淀檢測(cè)p65直接結(jié)合EGR1調(diào)控序列收集MT2細(xì)胞,利用染色體共沉淀檢測(cè)p65直接結(jié)合EGR1調(diào)控序列。3.p65介導(dǎo)的EGR1表達(dá)分析:(1)NFκB抑制劑BAY 11-7082對(duì)EGR1表達(dá)的影響在MT2細(xì)胞和Tax P細(xì)胞上清中加入BAY 11-7082或轉(zhuǎn)染p65 sh RNA,檢測(cè)EGR1和p65蛋白的表達(dá)(2)不同Tax突變體對(duì)宿主細(xì)胞EGR1表達(dá)的影響將Tax突變體M22、M47和野生型Tax,轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞,檢測(cè)EGR1蛋白的表達(dá);將EGR1熒光素酶報(bào)告基因分別與M22、M47和Tax轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,檢測(cè)EGR1調(diào)控序列活性。4.EGR1對(duì)HTLV-1感染細(xì)胞中RELA表達(dá)的影響及機(jī)制探討將EGR1表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)Tax P細(xì)胞和MT2細(xì)胞,檢測(cè)EGR1、p65蛋白;將EGR1表達(dá)質(zhì)�；蜣D(zhuǎn)染Tax P細(xì)胞,觀察EGR1對(duì)p65入核的影響;將EGR1表達(dá)質(zhì)粒與NFκB熒光素酶報(bào)告基因p NFκB-luc共轉(zhuǎn)Tax P細(xì)胞和MT2細(xì)胞,檢測(cè)熒光素酶活性,或者提取核蛋白,利用凝膠電泳遷移率EMSA檢測(cè)NFκB結(jié)合DNA的能力。5.EGR1促進(jìn)HTLV-1感染細(xì)胞中NFKB活性機(jī)制探討PHA和PBS刺激Jurkat細(xì)胞后加入蛋白合成抑制劑CHX,分別于不同時(shí)間段收集細(xì)胞檢測(cè)EGR1蛋白的表達(dá);將Tax質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞24h后加入CHX,檢測(cè)EGR1和Tax蛋白的表達(dá);利用免疫共沉淀技術(shù),檢測(cè)Tax P細(xì)胞中Tax和EGR1的直接作用。6.HTLV-1在Hela細(xì)胞中的復(fù)制動(dòng)力學(xué)分析將HTLV-1陽(yáng)性T細(xì)胞MT2按照1:1的比例加入Hela細(xì)胞,1h后反復(fù)吹吸去除懸浮細(xì)胞后,收集不同時(shí)間段的細(xì)胞,western blot檢測(cè)核心抗原p19表達(dá),real-time PCR檢測(cè)病毒核酸拷貝。7.EGR1調(diào)控HTLV-1感染的機(jī)制分析(1)HTLV-1感染后對(duì)宿主細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響利用細(xì)胞共培養(yǎng)模型模擬病毒早期感染,檢測(cè)病毒感染后Hela細(xì)胞Cas3/9的活性和活性蛋白的變化。(2)HTLV-1感染后對(duì)宿主細(xì)胞細(xì)胞自噬的影響利用細(xì)胞共培養(yǎng)模型模擬病毒早期感染,檢測(cè)LC3B的表達(dá);將LC3B-EGFP載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,轉(zhuǎn)染結(jié)束后進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng),共聚焦顯微鏡檢測(cè)自噬體數(shù)目。(3)干擾EGR1對(duì)HTLV-1復(fù)制動(dòng)力學(xué)的影響將EGR1 si RNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后,加入等數(shù)量的MT2細(xì)胞共培養(yǎng),western blot檢測(cè)病毒感染后Hela細(xì)胞Cas3/9的活性、Cas3/cas9、LC3B、p19蛋白的表達(dá)、以及病毒核酸拷貝。結(jié)果1.EGR1在Tax蛋白陽(yáng)性細(xì)胞中的表達(dá)(1)HTLV-1陽(yáng)性T細(xì)胞中EGR1的表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HTLV-1陽(yáng)性T細(xì)胞系中EGR1 m RNA和蛋白的表達(dá)至少比對(duì)照細(xì)胞系HTLV-1陰性T細(xì)胞系高出近3倍,差異明顯(P0.01),表明HTLV-1感染可以導(dǎo)致宿主細(xì)胞EGR1表達(dá)升高。(2)Tax蛋白對(duì)T細(xì)胞中EGR1表達(dá)的影響檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Tax P細(xì)胞中EGR1m RNA和蛋白對(duì)照細(xì)胞系Tax N細(xì)胞高出近3倍,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Tax質(zhì)粒后,EGR1m RNA和蛋白的表達(dá)也隨著增高,差異均明顯(P0.01),且隨著質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量的升高而升高,這些結(jié)果均表明癌蛋白Tax可以導(dǎo)致宿主細(xì)胞EGR1的表達(dá)升高。(3)HTLV-1感染對(duì)宿主細(xì)胞EGR1表達(dá)的影響隨著共培養(yǎng)體系中加入的MT2細(xì)胞比例增大,癌蛋白Tax也隨著增高,同時(shí)EGR1 m RNA和蛋白的表達(dá)也明顯增高,結(jié)果提示病毒早期感染也可以導(dǎo)致宿主細(xì)胞EGR1表達(dá)升高。2.Tax蛋白陽(yáng)性細(xì)胞中EGR1表達(dá)調(diào)控特性的分析(1)構(gòu)建不同長(zhǎng)度的EGR1報(bào)告基因及其突變體成功構(gòu)建EGR1全長(zhǎng)報(bào)告基因E1以及截短體E2、E3和NBS缺失的Del E和-413/T-G點(diǎn)突變的Mut E。(2)報(bào)告基因活性分析將EGR1報(bào)告基因與p65 sh RNA轉(zhuǎn)染Tax P細(xì)胞和MT2細(xì)胞后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)E1、E2的熒光素酶活性明顯高于E3、Del E和Mut E,而與p65 sh RNA共轉(zhuǎn)染后明顯低于對(duì)照載體組E1和E2的熒光素酶活性。提示調(diào)控EGR1表達(dá)的區(qū)域主要位于-422~-401bp的NFκB結(jié)合位點(diǎn)。(3)染色體共沉淀檢測(cè)p65直接結(jié)合EGR1的調(diào)控序列染色體共沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p65可以直接結(jié)合EGR1的調(diào)控序列,區(qū)間位于-505bp~-223bp。3.p65介導(dǎo)的EGR1表達(dá)分析(1)NFκB抑制劑BAY 11-7082對(duì)EGR1表達(dá)的影響應(yīng)用p65 sh RNA沉默p65后,MT2細(xì)胞和Tax P細(xì)胞中EGR1的表達(dá)下降將近一倍,同樣地應(yīng)用NFκB抑制劑BAY 11-7082后,EGR1的表達(dá)下調(diào)近60%。(2)不同Tax突變體對(duì)宿主細(xì)胞EGR1表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染野生型Tax和突變體M47組,EGR1的蛋白表達(dá)和E1、E2熒光素酶報(bào)告基因活性明顯高于M22組(P0.05),而E3、Del E、Mut E活性差異不明顯(P0.05),說(shuō)明了不能激活NFκB途徑的突變體M22促進(jìn)EGR1表達(dá)的能力明顯受損。4.EGR1對(duì)HTLV-1感染細(xì)胞中RELA表達(dá)的影響及機(jī)制的探討發(fā)現(xiàn)EGR1可以促進(jìn)Tax P細(xì)胞和MT2細(xì)胞p65蛋白的表達(dá)和NFκB的活性,且隨著劑量增加而增加,EGR1還可以促進(jìn)p65蛋白入核和促進(jìn)NFκB結(jié)合DNA的能力,提示Tax蛋白陽(yáng)性細(xì)胞中EGR1和NFκB存在著正反饋調(diào)節(jié)。5.EGR1促進(jìn)HTLV-1感染細(xì)胞中NFκB活性的機(jī)制探討在Tax存在條件下EGR1蛋白的半衰期延長(zhǎng);免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Tax蛋白和EGR1蛋白存在著直接作用,這提示HTLV-1可能是通過(guò)Tax蛋白延長(zhǎng)EGR1蛋白的半衰期造成蛋白蓄積,導(dǎo)致宿主細(xì)胞中EGR1和NFκB的正反饋性持續(xù)活化。6.HTLV-1在Hela細(xì)胞中的復(fù)制動(dòng)力學(xué)分析細(xì)胞共培養(yǎng)模型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4h可以檢測(cè)到HTLV-1核心蛋白p19的表達(dá),但是8h時(shí)表達(dá)下降,隨后逐漸升高;real-time PCR檢測(cè)顯示病毒核酸拷貝隨著時(shí)間增加而逐漸增加。7.EGR1調(diào)控HTLV-1感染的機(jī)制分析(1)HTLV-1感染后對(duì)宿主細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響HTLV-1感染hela細(xì)胞后,cas3/7、cas9的活性和活化的cas3/9均無(wú)差異,提示病毒感染后不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。(2)HTLV-1感染后對(duì)宿主細(xì)胞細(xì)胞自噬的影響HTLV-1感染Hela細(xì)胞后,LC3B的表達(dá)和自噬體數(shù)目明顯高于未感染組(0h),且隨著時(shí)間增加LC3B表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P0.05),提示HTLV-1感染可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬。(3)干擾EGR1對(duì)HTLV-1復(fù)制動(dòng)力學(xué)的影響宿主細(xì)胞中,用si RNA沉默EGR1后,檢測(cè)顯示Cas3/9活性和活性Cas3/9蛋白的表達(dá)沒(méi)有差異,而自噬蛋白LC3B、HTLV-1核心蛋白p19的表達(dá)都明顯降低,免疫熒光也發(fā)現(xiàn)自噬體數(shù)目減少,提示EGR1通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬參與HTLV-1在宿主細(xì)胞中的復(fù)制動(dòng)力學(xué)。結(jié)論1.HTLV-1感染宿主細(xì)胞中EGR1的高表達(dá)調(diào)控受NFκB調(diào)控。2.EGR1和NFκB之間存在著正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,癌蛋白Tax可以通過(guò)直接結(jié)合EGR1延長(zhǎng)EGR1蛋白的半衰期,可能是EGR1和NFκB之間正反饋環(huán)的關(guān)鍵因素。3.HTLV-1感染可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬,EGR1可通過(guò)調(diào)節(jié)HTLV-1感染細(xì)胞的細(xì)胞自噬而影響病毒的復(fù)制。
[Abstract]:The expression of EGR1 mRNA and protein was detected by gene chip analysis . (4)鏌撹壊浣撳叡娌夋穩(wěn)媯，

本文編號(hào)：1712761