本文選題：蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)學(xué)　切入點(diǎn)：順磁探針　出處：《中國(guó)科學(xué)院研究生院(武漢物理與數(shù)學(xué)研究所)》2016年博士論文

【摘要】：蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)學(xué)特征是其行使功能的重要基礎(chǔ)。獲得高時(shí)間和空間分辨的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)學(xué)特征對(duì)了解生命運(yùn)動(dòng)的本質(zhì)、疾病的機(jī)制以及藥物的開發(fā)等有著十分重要的意義。解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)學(xué)的主要手段包括有：X射線晶體衍射、小角X光散射、冷凍電鏡、分子動(dòng)力學(xué)模擬、熒光共振能量轉(zhuǎn)移以及固體／液體核磁共振等方法。其中,液體核磁共振和冷凍電鏡的最大優(yōu)勢(shì)就是可以觀察生物大分子在水溶液中的結(jié)構(gòu)和功能的特征,其觀察的方法相比于X射線晶體衍射等方法更加趨近于生物大分子真實(shí)的生理?xiàng)l件。溶液順磁弛豫增強(qiáng)技術(shù)(solvent paramagnetic relaxation enhancement, sPRE)是近幾年發(fā)展出來(lái)的一種使用液體核磁共振來(lái)解析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)學(xué)的新手段,sPRE通過(guò)順磁中心的電子與核的偶極-偶極相互作用,提供蛋白質(zhì)長(zhǎng)程的距離和動(dòng)態(tài)學(xué)的信息。傳統(tǒng)順磁弛豫增強(qiáng)技術(shù)(paramagnetic relaxation enhancement, PRE)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)學(xué)的方法是通過(guò)在蛋白質(zhì)上引入Gd3+, Mn2+,氮氧自由基等順磁探針,觀察探針的順磁中心與蛋白質(zhì)上核的偶極-偶極相互作用來(lái)獲取距離的信息,而sPRE實(shí)驗(yàn)實(shí)際上是觀察蛋白質(zhì)上核的暴露程度的信息。此外,像傳統(tǒng)PRE一樣,sPRE還可以獲得蛋白質(zhì)瞬態(tài)的、低分布的動(dòng)態(tài)學(xué)信息。以往通過(guò)sPRE解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)所使用的探針是Gd-DTPA-BMA(又稱釓雙胺,Omnicscan(?)), DTPA-BMA通過(guò)8個(gè)配位原子外加溶液中的水分子與三價(jià)釓離子形成配位。然而在許多蛋白的sPRE實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)使用Gd-DTPA-BMA探針在某些條件下會(huì)與蛋白質(zhì)的H-N發(fā)生氫交換,使得sPRE值存在異常(與理論計(jì)算值和其他實(shí)驗(yàn)值明顯不符),影響了sPRE對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)描述的準(zhǔn)確性。為了改善這一情況,我們發(fā)展了新的運(yùn)用于解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的溶液順磁弛豫增強(qiáng)的探針Gd-TTHA-TMA和Gd-DTPA-BEA,這類探針可以解決原先在使用探針Gd-DTPA-BMA時(shí)存在的氫交換問(wèn)題,可以更為準(zhǔn)確的對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)學(xué)的信息進(jìn)行精確地描述。相對(duì)于傳統(tǒng)使用的Gd-DTPA-BMA探針,我們發(fā)展的Gd-TTHA-TMA可以提供10個(gè)配位基團(tuán)給順磁金屬,因此可以消除水分子配位導(dǎo)致的氫交換對(duì)蛋白sPRE實(shí)驗(yàn)值準(zhǔn)確性的影響。我們通過(guò)對(duì)不同的蛋白進(jìn)行測(cè)試,sPRE結(jié)果證實(shí)Gd-TTHA-TMA探針可以提供更加可靠的sPRE實(shí)驗(yàn)值,可以對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)學(xué)信息進(jìn)行更加精確地描述。我們發(fā)現(xiàn)在某些情況下Gd-TTHA-TMA探針會(huì)與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域發(fā)生結(jié)合,從而影響了sPRE的準(zhǔn)確性。為此我們又開發(fā)了新的sPRE探針Gd-DTPA-BEA作為補(bǔ)充,與Gd-TTHA-TMA相互印證,獲取更加準(zhǔn)確可靠的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)學(xué)的信息。隨后,我們發(fā)展了一套sPRE實(shí)驗(yàn)聯(lián)合分子動(dòng)力學(xué)模擬來(lái)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)學(xué)的新方法。我們用腺苷激酶(AdK)蛋白作為研究對(duì)象,通過(guò)我們新發(fā)展的探針獲得holo態(tài)和apo態(tài)的sPRE實(shí)驗(yàn)值,在分子動(dòng)力學(xué)模擬的結(jié)構(gòu)池中挑選吻合計(jì)算值的結(jié)構(gòu),解析出了AdK蛋白在各種狀態(tài)下的動(dòng)態(tài)學(xué)特征。相較于傳統(tǒng)的PRE方法,新方法的優(yōu)勢(shì)在于可以不用連接探針影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)；而相對(duì)于只能獲取兩點(diǎn)之間距離信息的熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法而言,新方法可以獲得更多殘基間的距離和動(dòng)態(tài)學(xué)的信息。此外,sPRE除了解析蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)學(xué)特征以外,我們還利用sPRE實(shí)驗(yàn)來(lái)解析蛋白質(zhì)寡聚的四級(jí)結(jié)構(gòu)的形態(tài),通過(guò)不同寡聚狀態(tài)下的human leptinW100D蛋白的sPRE實(shí)驗(yàn),我們給出了蛋白三聚的界面,搭建了human leptinW100D蛋白的寡聚的四級(jí)結(jié)構(gòu)模型。除了游離態(tài)的順磁探針可以運(yùn)用于sPRE實(shí)驗(yàn)之外,連接在蛋白上的順磁探針可以用來(lái)解析傳統(tǒng)的PRE和PCS獲取蛋白質(zhì)上距離和角度的信息。為此我們開發(fā)了一種基于點(diǎn)擊化學(xué)的蛋白質(zhì)定點(diǎn)標(biāo)記的順磁探針,該類探針可以通過(guò)生物正交的反應(yīng)連接在蛋白質(zhì)的非天然氨基酸上,具有優(yōu)異的選擇性和特異性,可以避免巰基連接探針的缺點(diǎn)。此外,熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)也是研究生物大分子結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)學(xué)的重要手段。我們發(fā)展了兩種用于FRET實(shí)驗(yàn)的熒光探針I(yè)AM-Cyanine3和IAM-Cyanine5,其特點(diǎn)在于：1)相對(duì)于常用的探針,我們縮短了發(fā)光基團(tuán)與蛋白質(zhì)間的linker長(zhǎng)度,使得探針具有更好的剛性,提高了FRET實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)描述的準(zhǔn)確性；2)我們改進(jìn)了熒光探針?lè)磻?yīng)連接的方式,使其具有更好的反應(yīng)特異性。綜上所述,本課題以發(fā)展解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)學(xué)的化學(xué)生物學(xué)方法為主線,開發(fā)用于解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)學(xué)的游離態(tài)的順磁探針、標(biāo)記順磁探針、熒光探針為研究重點(diǎn),開拓解析蛋白結(jié)構(gòu)的新技術(shù)新方法,提高解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)學(xué)的準(zhǔn)確性。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院研究生院(武漢物理與數(shù)學(xué)研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q617;O657.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 史冊(cè);李云琦;;小角X光散射在蛋白質(zhì)及其復(fù)合物領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J];高分子學(xué)報(bào);2015年08期

2 阮科;高佳;馬榮聲;;基于片段的先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)中的核磁應(yīng)用[J];波譜學(xué)雜志;2012年02期

3 劉主;唐淳;;順磁弛豫增強(qiáng)技術(shù)與蛋白質(zhì)瞬態(tài)結(jié)構(gòu)[J];波譜學(xué)雜志;2011年03期

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本文編號(hào)：1703341