本文選題：水稻　切入點(diǎn)：圖位克隆　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：葉綠體中的多蛋白復(fù)合體大多由葉綠體基因編碼的核心亞基與核基因編碼的外圍亞基組成,葉綠體的分化、發(fā)育、功能和維持均依賴于葉綠體基因與核基因的緊密協(xié)同表達(dá)。葉綠體的分化和發(fā)育需要葉綠體基因的正確表達(dá),葉綠體基因由葉綠體RNA聚合酶負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄。葉綠體中至少存在兩種類型的RNA聚合酶:核基因編碼的單亞基RNA聚合酶NEP和葉綠體基因編碼的多亞基RNA聚合酶PEP。NEP主要在葉綠體發(fā)育的早期轉(zhuǎn)錄持家基因。PEP是成熟葉綠體中最重要的RNA聚合酶。PEP復(fù)合體的任何改變都可能導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性受損,使葉綠體發(fā)育異常。pap突變體的白化或黃化表型表明PAPs對(duì)于PEP的功能十分重要。所有的PAPs都屬于TACs,但并非所有的擬南芥tac單突變體都表現(xiàn)白化或黃化表型。WHY蛋白和pTAC12蛋白在擬南芥和玉米中的分布說(shuō)明PEP復(fù)合體的組成在雙子葉植物和單子葉植物中存在一定差異。目前關(guān)于PEP復(fù)合體外圍亞基的研究主要在擬南芥中進(jìn)行,在玉米中也有少量相關(guān)基因被克隆,但水稻中尚無(wú)此類突變體的報(bào)道。盡管很多pap和/或tac突變體的研究顯示這些核基因編碼的外圍亞基與PEP復(fù)合體相關(guān)聯(lián)且對(duì)PEP的功能很重要,但各個(gè)外圍亞基之間的關(guān)系并不是很清楚。本研究中,我們以一個(gè)新的水稻葉綠體缺陷突變體wsl3為材料,利用圖位克隆分離到了目的基因WSL3。WSL3基因中9個(gè)核苷酸的缺失導(dǎo)致了突變體的苗期表型,與之相伴的是葉綠素含量降低和葉綠體基因表達(dá)異常。WSL3能夠自身互作,也能與PEP復(fù)合體的其他亞基互作。雖然WSL3包含一個(gè)可與DNA結(jié)合的SAP結(jié)構(gòu)域,但并不能直接結(jié)合葉綠體DNA。綜上所述,本研究認(rèn)為WSL3通過(guò)與PEP外圍亞基的互作來(lái)影響PEP的轉(zhuǎn)錄活性。本研究也發(fā)現(xiàn)WSL3能夠與RbcL互作,說(shuō)明WSL3可能參與了 RuBisCo的代謝活動(dòng)。本研究首次明確了 WSL3與PEP其他外圍亞基間的關(guān)系,為進(jìn)一步了解水稻葉綠體發(fā)育的機(jī)制和PEP復(fù)合體的組成及外圍亞基的功能奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:(1)水稻葉綠體缺陷突變體wsl3是一個(gè)對(duì)溫度敏感的葉色突變體。觀察突變體wsl3的葉綠體超微結(jié)構(gòu)和葉綠素含量發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)白化表型的部位僅有少量未發(fā)育的葉綠體或無(wú)葉綠體存在。(2)突變體wsl3的白化或白條紋表型受一個(gè)隱性核基因控制。本研究利用圖位克隆的方法將目的基因定位到了 10號(hào)染色體長(zhǎng)臂的66-kb區(qū)間,測(cè)序發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)LOC_Osl0g32540的第9個(gè)外顯子中缺失了 9個(gè)核苷酸。LOC_Os10g32540編碼一個(gè)包含SAP結(jié)構(gòu)域和一個(gè)截短的PLN03218結(jié)構(gòu)域的蛋白。轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)了LOC_OslOg32540就是我們的目的基因,將其命名為WHITE STRIPE LEAF 3 (WSL3)。(3) WSL3蛋白廣泛存在于陸生植物中,WSL3是擬南芥AtpTAC3的同源蛋白,缺失的3個(gè)氨基酸在陸生植物中高度保守。亞細(xì)胞定位和Western-blot證實(shí)WSL3定位于葉綠體擬核。WSL3主要在葉綠體發(fā)育的第二個(gè)階段表達(dá)。WSL3的表達(dá)受光誘導(dǎo)。葉綠體編碼基因的表達(dá)分析說(shuō)明突變體wsl3的PEP活性下降。以上結(jié)果揭示W(wǎng)SL3可能對(duì)PEP的轉(zhuǎn)錄活性具有重要作用。(4) WSL3與水稻PEP復(fù)合體的外圍亞基PAP2、PAP3、PAP4、PAP5、PAP7和PAP10互作。使用截?cái)嗟腤SL3片段與以上OsPAPs的Y2H試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)WSL3中截短的PLN03218結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)WSL3與OsPAPs的互作。WSL3有一個(gè)SAP結(jié)構(gòu)域,可能參與了 PEP復(fù)合體識(shí)別并與PEP依賴基因的啟動(dòng)子結(jié)合的過(guò)程,但cpChIP和Y1H試驗(yàn)顯示W(wǎng)SL3參與了 PEP轉(zhuǎn)錄的整個(gè)過(guò)程,且不能直接與葉綠體DNA結(jié)合。以上結(jié)果說(shuō)明WSL3是通過(guò)與其他外圍亞基的互作來(lái)影響PEP的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而影響葉綠體的正常發(fā)育。本研究也發(fā)現(xiàn)WSL3能夠與RuBisCo的大亞基RbcL互作,提示了PEP復(fù)合體功能的多樣性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2

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