發(fā)布時間：2018-03-27 21:51

  本文選題：柿　切入點：脂氧合酶　出處：《西北農(nóng)林科技大學》2016年博士論文

【摘要】：柿果實富含營養(yǎng)物質(zhì)和礦物質(zhì),有藥用和保健功效,是北方重要的秋冬水果之一。柿屬于呼吸躍變型果實,采收后短期內(nèi)易軟爛,致鮮果流通困難,造成嚴重的經(jīng)濟損失。因此,如何控制果實后熟軟化成為柿果貯藏中的關鍵問題。脂氧合酶能啟動植物細胞膜的膜脂過氧化反應,造成細胞膜降解,最終導致果實的成熟軟化或葉片的衰老。目前對脂氧合酶的研究主要集中于成熟衰老和脅迫誘導其表達方面,而關于脂氧合酶在果實采后軟化和抗逆反應過程中的分子調(diào)控機制并沒有系統(tǒng)的研究。本文以‘富平尖柿’(Diospyros kaki L.cv.Fuping Jianshi)為試材,探討了柿脂氧合酶基因在不同組織、果實發(fā)育期和采后脅迫處理中的表達模式;并進一步地以轉基因番茄和轉基因擬南芥為材料,驗證了脂氧合酶在衰老和抗逆反應中的功能。主要結果如下:1.以柿不同組織和發(fā)育期的果實為材料,探討LOX基因的表達模式。結果表明:DkLOX1在果實中特異表達,DkLOX4在果實、莖、葉、花和花萼中均表達;DkLOX1和DkLOX4在幼果中表達量較DkLOX3高,且表達高峰與幼果生長雙“S”曲線保持一致;DkLOX3在所有組織均表達,在幼果中的表達量較低。這些結果表明DkLOX1和DkLOX4可能與果實的生長發(fā)育有關。2.以初熟期的柿果實為材料,探討經(jīng)損傷、高二氧化碳、低氧和低溫脅迫處理后果實中LOX基因的表達特點。結果表明:與對照相比,高二氧化碳促進DkLOX1的表達,損傷和低溫促進DkLOX4的表達;DkLOX1和DkLOX4在其他處理中出現(xiàn)隨著果實的成熟衰老表達下降的趨勢;DkLOX3的表達量和脂氧合酶的活性在果實采收后顯著提高,并且所有處理的DkLOX3表達高峰與乙烯釋放峰同步。此外,與對照相比,損傷處理后DkLOX3的表達快速提高并一直保持較高水平,高二氧化碳處理4天時DkLOX3的表達急劇升高后下降并在呼吸躍變前穩(wěn)定高表達。這些結果表明DkLOX1和DkLOX4可能不參與果實的成熟衰老,而DkLOX3可能在果實的成熟衰老和脅迫響應中起到重要的作用。3.構建DkLOX3-pVBG2307過表達載體,分別得到番茄和擬南芥轉基因植株。結果發(fā)現(xiàn),轉基因番茄綠熟期的果實在采收后轉色速度加快、乙烯釋放峰提前、MDA含量提高、乙烯合成關鍵基因ACS2、ACO1和ACO3的表達量提高;轉基因擬南芥離體葉片和整棵植株在黑暗誘導下的衰老加速,伴隨著更高的葉綠素降解、電解質(zhì)滲漏率、丙二醛含量、活性氧積累和細胞死亡比例。這些結果為脂氧合酶在果實成熟軟化和葉片衰老中的作用提供了直接的證據(jù)。4.轉基因擬南芥種子在含有130 mM NaCl和200 mM甘露醇的滲透脅迫培養(yǎng)基上發(fā)芽率更高,幼苗的根的生長受到的抑制也較野生型輕。干旱處理下,轉基因擬南芥葉片的卷曲程度低于野生型,當恢復澆水后24小時,更多的轉基因植株恢復正常生長。鹽脅迫處理下,轉基因擬南芥幼苗的生長受到的抑制比野生型輕,蓮座葉直徑大于野生型。干旱和鹽脅迫處理下轉基因擬南芥積累的O2-和H2O2更少,ABA依賴途徑中的正調(diào)控基因RD22、RD29B和NCED3表達量上調(diào),負調(diào)控基因FRY1表達下調(diào),同時,ABA非依賴途徑的正調(diào)控基因RD29A表達量也上調(diào)。這些結果表明了脂氧合酶可能通過調(diào)控活性氧積累和脅迫響應基因的表達來提高了對非生物脅迫的抗性。5.對轉基因和野生型擬南芥的離體葉片接種活體營養(yǎng)型菌Pst DC3000,結果表明,過表達DkLOX3的轉基因擬南芥提高了對Pst DC3000的抗性。受Pst DC3000侵染后,轉基因葉片在12h和24h積累的O2-、H2O2和死細胞數(shù)量高于野生型,LOX酶活高于野生型,然而自由基清除酶POD、CAT和SOD的活性較低,出現(xiàn)過敏反應。Pst DC3000侵染后48h和72h,轉基因葉片的自由基清除酶POD、CAT和SOD的活性逐漸高于野生型,自由基積累減緩,葉片中菌的擴繁量也低于野生型。此外,轉基因擬南芥葉片中的SA含量及其標記基因PR1和PR2的表達顯著高于野生型,而轉基因葉片中的JA含量及其標記基因PDF1.2的表達與野生型無顯著差異。這些結果表明了脂氧合酶可能通過調(diào)控ROS的積累和SA合成來提高對Pst DC3000的抗性。6.對轉基因和野生型擬南芥的離體葉片接種死體營養(yǎng)型菌-灰霉菌,結果表明,過表達DkLOX3的轉基因擬南芥提高了對灰霉菌的抗性。受灰霉菌侵染后,轉基因葉片在12h積累的O2-和H2O2高于野生型,自由基清除酶POD、CAT和SOD的活性較低。侵染24h后,轉基因葉片的自由基清除酶POD、CAT和SOD的活性較野生型高,自由基積累速度減緩,且逐漸集中在病灶部位,而野生型擬南芥葉片中的自由基快速積累。轉基因擬南芥葉片中的SA、JA含量及其標記基因的表達量與野生型相比均無顯著差異。這些結果表明了脂氧合酶可能通過調(diào)控早期活性氧的積累,但并不通過調(diào)控SA或JA代謝途徑提高對灰霉菌的抗性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

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本文編號：1673376