本文選題：腸外致病性大腸桿菌　切入點(diǎn)：多聚磷酸激酶　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：大腸桿菌可引起人和動(dòng)物的腸內(nèi)腸外各種疾病,給畜牧養(yǎng)殖造成重大經(jīng)濟(jì)損失并嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。目前,對(duì)抗細(xì)菌病原主要依靠抗生素和宿主自身免疫系統(tǒng)。抗生素通過干擾細(xì)菌必要的合成代謝發(fā)揮殺菌抑菌作用,而宿主則通過免疫細(xì)胞和免疫分子發(fā)揮抗細(xì)菌感染作用。正因?yàn)榇?細(xì)菌進(jìn)化出抵御外界不良環(huán)境的能力,除了環(huán)境選擇使細(xì)菌獲得藥物降解、靶點(diǎn)突變或修飾的能力,細(xì)菌還會(huì)調(diào)控抗性蛋白、外排泵和胞內(nèi)運(yùn)輸基因表達(dá)抵御抗生素?fù)p傷;而重要免疫因子過氧化氫刺激時(shí),細(xì)菌上調(diào)表達(dá)過氧化氫酶、谷還原酶、超氧化物歧化酶等以對(duì)抗氧化壓力,細(xì)菌的這一能力被稱為“壓力應(yīng)激”。實(shí)現(xiàn)壓力應(yīng)激調(diào)控需要將胞外信號(hào)通過細(xì)胞膜上受體傳遞至胞內(nèi),改變RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)以應(yīng)對(duì)不良環(huán)境刺激。在細(xì)菌中,四(五)磷酸鳥苷酸pp Gpp(p)和多聚磷酸poly P是細(xì)菌應(yīng)對(duì)不良環(huán)境的重要信號(hào)分子。pp Gpp(p)由三磷酸鳥嘌呤焦磷酸合成酶Rel A催化GTP焦磷酸化合成,該分子在氨基酸饑餓、碳營(yíng)養(yǎng)缺乏、紫外線照射、氧化應(yīng)激和滲透壓等壓力應(yīng)激中均發(fā)揮重要作用。poly P由多聚磷酸激酶PPK以ATP和GTP為原料催化合成的高能磷酸多聚物,廣泛存在于微生物細(xì)胞中,在細(xì)菌中發(fā)揮多種功能,缺失PPK會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌毒力下降、存活能力和運(yùn)動(dòng)能力降低、群體感應(yīng)和壓力應(yīng)激損傷。鑒于poly P在壓力應(yīng)激方面的重要作用,本研究構(gòu)建了ppk缺失株Δppk,通過最小抑菌濃度測(cè)定、殺菌實(shí)驗(yàn)、基因表達(dá)檢測(cè)(RNA-seq和q RT-PCR)、生物膜形成分析等方法研究PPK在腸外致病性大腸桿菌PCN033抗生素耐受中的作用;而poly P和pp Gpp(p)在過氧化氫耐受中均發(fā)揮基因調(diào)控作用,因此本研究在缺失株Δppk基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙基因缺株Δrel A-Δppk和Rel A缺失株Δrel A,通過最小抑菌濃度測(cè)定、抑菌實(shí)驗(yàn)、q RT-PCR、western blot等方法研究PPK在腸外致病性大腸桿菌PCN033中的相互調(diào)控關(guān)系,得到以下結(jié)果:1.浮游狀態(tài)下,缺失株Δppk較野生株對(duì)抗生素敏感依據(jù)抗生素作用靶點(diǎn),將本研究所選用的抗生素分為四類:破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的β-內(nèi)酰胺類和糖肽類、干擾蛋白質(zhì)合成的氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類、干擾核酸合成的喹諾酮類和硝基呋喃類、破壞細(xì)胞膜的肽脂類。MIC分析顯示,缺失株Δppk較野生株對(duì)抗生素敏感,尤其是對(duì)具有破壞細(xì)菌細(xì)胞壁功能的β-內(nèi)酰胺類和干擾蛋白質(zhì)合成的氨基糖苷類抗生素敏感�？股貧⒕鷮�(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,浮游狀態(tài)下,缺失株Δppk更容易被抗生素殺死。上述結(jié)果表明PPK參與抗生素耐受。2.RNA-seq和q RT-PCR檢測(cè)缺失株Δppk的抗生素耐受相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)未經(jīng)抗生素處理的突變株Δppk和野生株WT進(jìn)行RNA-seq和q RT-PCR驗(yàn)證分析,結(jié)果顯示,16個(gè)抗性蛋白基因中僅tet B上調(diào)表達(dá);參與抗生素外排的35個(gè)基因中下調(diào)表達(dá)的基因?yàn)閙ar A、mar B和mdt A;上調(diào)表達(dá)的基因?yàn)閙dt G和madt E;參與抗生素胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的基因中僅omp C上調(diào)。無(wú)抗生素處理時(shí),參與抗生素耐受的相關(guān)基因基因表達(dá)在野生株和突變株中沒有顯著性變化。對(duì)突變株Δppk和WT進(jìn)行他唑巴坦和慶大霉素處理,進(jìn)行q RT-PCR驗(yàn)證。他唑巴坦處理會(huì)導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺類抗性蛋白基因bla(amp C)上調(diào),同時(shí)上調(diào)的基因還有aac,arn A,nfs A;慶大霉素處理對(duì)抗性蛋白基因的表達(dá)沒有影響,盡管突變株Δppk與WT之間外排基因均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),但沒有顯著性差異。對(duì)隨機(jī)篩選的外排泵基因進(jìn)行q RT-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,他唑巴坦和慶大霉素處理均會(huì)使acr A、acr D、cus C、emr A、mdt A和mar A顯著性上調(diào),但突變株Δppk的上調(diào)倍數(shù)低于WT。他唑巴坦處理對(duì)水孔蛋白基因表達(dá)基本沒有影響,而慶大霉素處理則會(huì)導(dǎo)致內(nèi)入基因omp C、omp F和pho E下調(diào)表達(dá),但缺失株Δppk中下降的倍數(shù)顯著低于WT。在抗生素處理?xiàng)l件下,參與抗生素耐受的相關(guān)基因表達(dá)在WT和Δppk中具有顯著性差異,說(shuō)明PPK參與抗生素壓力應(yīng)激是通過接受刺激信號(hào)后調(diào)控抗性蛋白、外排泵和胞內(nèi)運(yùn)輸基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)。3.q RT-PCR驗(yàn)證poly P對(duì)參與抗生素耐受的雙組分系統(tǒng)(TCSs)的激活情況由于抗性蛋白基因bla(amp C),胞內(nèi)運(yùn)輸基因omp C,omp F和外排泵基因acr A,acr F,acr D分別受到雙組分調(diào)控系統(tǒng)Fim Z,Omp R和Pho B,Cpx R,Evg A和Tor R的調(diào)控。對(duì)參與抗生素耐受的雙組分調(diào)控系統(tǒng)Fim Z,Evg A,Omp R,Pho B,Bae R,Cpx R,Tor R的下游基因amp C,emr KY,omp CF,pho A,tor ACD,mdt AB和deg P進(jìn)行RNA-seq和q RT-PCR驗(yàn)證。未經(jīng)抗生素時(shí),與野生株相比,Fim Z調(diào)控的抗性蛋白基因amp C沒有顯著性變化;Bae R調(diào)控的mdt A顯著性下調(diào),其他雙組分調(diào)控的下游基因沒有顯著性變化;而Omp R調(diào)控的omp C和omp F表達(dá)顯著性上調(diào)。對(duì)WT和缺失株Δppk進(jìn)行慶大霉素處理,同時(shí)將敏感性未發(fā)生改變的諾氟沙星作為對(duì)照,進(jìn)行q RT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明,諾氟沙星處理,與未處理野生株相比,僅有Fim Z下游基因amp C表達(dá)上調(diào),而突變株Δppk內(nèi)表達(dá)未有顯著性變化。慶大霉素處理,與未處理野生株WT相比,Tor R,Bae R,Cpx R下游基因的表達(dá)均顯著性上調(diào),且顯著性高于Δppk.過表達(dá)poly P合成酶基因ppk會(huì)導(dǎo)致Fim Z,Evg A,Pho B,Tor R,Bae R和Cpx R下游基因表達(dá)上調(diào),而過表達(dá)poly P外切酶基因ppx則會(huì)導(dǎo)致這些雙組分下游基因表達(dá)下調(diào)。結(jié)果表明,poly P參與雙組分系統(tǒng)的激活與調(diào)控,并參與抗生素耐受。4.PPK參與生物膜形成且因而影響抗生素耐受剛果紅染色實(shí)驗(yàn)表明,與生物膜形成相關(guān)的胞外多糖等物質(zhì)合成減少,表明Δppk缺失株生物膜形成受損�？股匚刺幚�?xiàng)l件下,RNA-seq顯示突變株Δppk中參與生物膜形成的鞭毛基因、菌毛基因表達(dá)下調(diào);同時(shí),他唑巴坦和慶大霉素處理?xiàng)l件下,盡管鞭毛和菌毛基因的表達(dá)趨勢(shì)不變,但參與生物膜形成的調(diào)控因子ydd V、mcb R和bol A基因在WT中上調(diào)而突變株Δppk中下調(diào),基因表達(dá)結(jié)果與缺失株Δppk生物膜形成受損的表型較為符合,說(shuō)明PPK參與生物膜合成。MIC結(jié)果顯示,Δppk突變株的生物膜細(xì)胞與WT的生物膜細(xì)胞具有相同的抗生素敏感性。同時(shí),抗生素清除突變株Δppk和WT生物膜的效率幾乎沒有差異。最后,抗生素殺菌實(shí)驗(yàn)表明,他唑巴坦和慶大霉素對(duì)Δppk突變株和WT突變株的生物膜細(xì)胞具有相同的殺菌效果。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明,生物膜參與抗生素耐受,而PPK不影響細(xì)菌生物膜細(xì)胞狀態(tài)下的抗生素耐受。5.PPK與Rel A均參與過氧化氫耐受且均影響細(xì)菌致病能力MIC分析和過氧化氫殺菌實(shí)驗(yàn)表明,缺失株Δppk、缺失株Δrel A和雙缺失株Δppk-Δrel A相比于WT對(duì)過氧化氫的耐受程度下降。殺菌實(shí)驗(yàn)表明,PPK與Rel A協(xié)同參與過氧化氫耐受。盡管過氧化氫處理不會(huì)導(dǎo)致WT內(nèi)poly P含量發(fā)生顯著性變化,但是在PPK過表達(dá)的菌株中,過氧化氫處理會(huì)導(dǎo)致poly P含量顯著性上升,poly P在此過程中發(fā)揮過氧化氫應(yīng)激調(diào)控功能。對(duì)野生株、突變株Δrel A和Δppk進(jìn)行倍比稀釋,將107、106劑量的細(xì)菌進(jìn)行昆明小鼠攻毒實(shí)驗(yàn),缺失株Δppk和Δrel A的小鼠死亡數(shù)目下降、存活時(shí)間延長(zhǎng)。細(xì)菌攻毒實(shí)驗(yàn)表明,PPK和Rel A參與細(xì)菌致病過程。6.PPK調(diào)控pp Gpp(p)合成酶基因rel A表達(dá)q RT-PCR表明,缺失株Δppk內(nèi)rel A表達(dá)輕微下調(diào),在PPK過表達(dá)的菌株中,rel A表達(dá)顯著性上調(diào);同時(shí),Western Blot分析顯示過表達(dá)PPK會(huì)導(dǎo)致Rel A蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。在PCN033中過表達(dá)大腸桿菌本身的PPX不會(huì)導(dǎo)致rel A下調(diào),但過表達(dá)釀酒酵母超強(qiáng)活性的PPX則會(huì)導(dǎo)致rel A處于幾乎不表達(dá)的狀態(tài)。該結(jié)果表明,發(fā)揮rel A基因表達(dá)調(diào)控功能的應(yīng)該為poly P分子而非PPK蛋白。說(shuō)明PPK在rel A表達(dá)過程中發(fā)揮調(diào)控功能。7.rel A基因上游調(diào)控序列TCSs結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)與TCSs蛋白表達(dá)過表達(dá)TCSs反應(yīng)調(diào)控因子,進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)多對(duì)雙組分系統(tǒng)參與調(diào)控rel A基因的表達(dá)。對(duì)rel A基因上游1000bp的序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,分別找出了雙組分反應(yīng)調(diào)控因子Pho B,Omp R,Cpx R,Dpi A,Bas R,Bae R,Tor R,Arc A可能的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建Env Z-Omp R,Pho P-Pho B,Cpx A-Cpx R,Tor S-Tor R,Bae S-Bae R,Evg S-Evg A等12個(gè)蛋白,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),以poly P為供體進(jìn)行體外磷酸化TCSs蛋白,并進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn),確定TCSs在rel A基因上游確定的結(jié)合位點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 王中強(qiáng);邱少富;王勇;孫巖松;宋宏彬;;多位點(diǎn)序列分型技術(shù)及其研究進(jìn)展[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2010年01期

2 張少敏;徐建國(guó);;多位點(diǎn)序列分型及其應(yīng)用[J];疾病監(jiān)測(cè);2008年10期

3 何素芬;原志偉;朱國(guó)強(qiáng);;禽致病性大腸桿菌Ⅰ型菌毛fimH基因缺失突變株的構(gòu)建及部分生物學(xué)特性的分析[J];微生物學(xué)報(bào);2008年02期

4 綦成;張春燕;亓慶國(guó);;白色念珠菌生物膜形成的定量分析和形態(tài)學(xué)觀察[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2006年12期

5 徐偉文;多位點(diǎn)酶電泳法在分子流行病學(xué)中的應(yīng)用[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊(cè));1995年06期

，

本文編號(hào)：1664428